Clasificación de las enzimas pectolíticas

Hasta hace poco, las revisiones bibliográficas sobre enzimas pécticas solamente describían las enzimas que actuaban sobre el HG 50, 50, 51_{, pero recientemente se han}

descubierto varias enzimas que actúan sobre la región RamnoGalacturonano I (RG I)

52,53,54_{. Las enzimas que actúan sobre el HG y el RG I pueden ser divididas a su vez en}

enzimas depolimerizantes y desesterificantes. Las enzimas depolimerizantes se clasifican de acuerdo a los siguientes criterios: 1) tipo de ruptura de los enlaces glicosídicos: hidrolítico o transeliminativo, 2) mecanismo de la reacción: tipo exo o endo, y 3) preferencia de actividad respecto del grado de esterificación metílica del sustrato (alto o bajo). Las enzimas desesterificantes se clasifican de acuerdo al tipo de grupo éster que hidrolizan, ya sea metil-, acetil- o feruil-éster.

La clasificación de las pectinasas mencionada se refiere a la acción de estas enzimas sobre sustratos solubles. Algunos autores han descrito una clase adicional de pectinasas teniendo en cuenta su acción sobre sustratos insolubles; son las denominadas protopectinasas (PPasas). Estas son definidas como enzimas capaces de degradar “protopectina” (la pectina insoluble del tejido vegetal) generando pectina soluble de alto peso molecular38_{. Sin embargo, después de la caracterización de varias}

PPasas, se determinó que su mecanismo de acción es similar al descripto para las pectinasas caracterizadas con sustratos solubles (hidrolíticas, transeliminativas, específicas de la región HG o del RG I). Mas aún, se ha demostrado que el gen que codifica la actividad “protopectinasa” de Geotrichum klebahnii muestra una consistente

homología con las clásicas PGasas 55;56_{. Por lo tanto, si bien en diversas revisiones}

bibliográficas se incluyen a las PPasas como grupo adicional dentro de la clasificación de las enzimas pécticas, no existirían razones para considerarlas como tal y la actividad “protopectinasa” debe considerarse como una actividad natural de ciertas enzimas pectolíticas, aunque algunas de ellas puedan ser más eficientes que otras en hidrolizar protopectina 52_{. Un importante paso para la clasificación de las glicosidasas}

ha sido su agrupación en 28 familias sobre la base de similitudes en la secuencia. En esta agrupación se incluye las pectinasas 57_.

La clasificación de las pectinasas se puede detallar como sigue:

1.3.2.1. Enzimas que atacan el esqueleto principal de los polímeros pécticos

1.3.2.1.1 Poligalacturonasas (PGasas; EC 3.2.1.15): actúan básicamente sobre el HG

hidrolizando las uniones glicosídicas entre residuos no esterificados y pueden ser divididas en tres grupos de acuerdo a su acción sobre el sustrato ácido poligalacturónico (APG): endo-PGasas que atacan el sustrato en forma aleatoria

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generando mezclas de oligómeros, tri y digalacturonatos y AGA; las exo-PGasas tipo I (galacturonano -(1 4)-galacturonosidasa) que liberan AGA del extremo no reductor y las exo-PGasas tipo II (exo-poli- -galacturonosidasa) que liberan digalacturonato del extremo no reductor. Las endo-PGasas y exo-PGAsa tipo I fueron identificadas en varios hongos filamentosos y han sido estudiadas extensamente 58_.

1.3.2.1.2 Polimetilgalacturonasas (EC. 3.1.1.11): esta enzima degradaría el HG

altamente metoxilado, aunque su existencia es fuente permanente de controversia. Algunos reportes sobre la presencia de dicha actividad enzimática se atribuyen en realidad a la actividad de la PGasa contaminada con pectin-metilesterasa 50_.

1.3.2.1.3 Pectin y pectato-liasas (EC. 4.2.2.2 y EC 4.2.2.10): estas enzimas degradan

el HG mediante un mecanismo de transeliminación, introduciendo un doble enlace entre el C-4 y el C-5 del extremo no reductor formado en la reacción. Las HG liasas se dividen en aquellas que degradan pectina con bajo grado de metoxilación (pectato- liasas, PL) y las que hidrolizan pectina altamente metoxilada (pectin-liasas, PeL). No se han encontrado liasas en plantas y la fuente más común de estas enzimas son las bacterias y hongos filamentosos, en particular los fitopatógenos. Las pectato-liasas requieren Ca+2 _{para su actividad, pero no así la PeL. Otras liasas descriptas son la}

exo-pectatoliasa y las oligogalacturonato liasas, las cuales a diferencia de las exo- poligacturonasas y las oligogalacturonato hidrolasas, atacan el sustrato desde el extremo reductor 59_.

1.3.2.2 Enzimas que actúan sobre el RG:

La primera descripción de una enzima capaz de degradar la cadena principal del RGI fue hecha en 1990 y se denominó ramnogalacturonasa (RGasa, EC no asignado). El nombre actual es -D-galactopiranosilurónico-(1,2)- -L-ramnopiranosil hidrolasa, que

se abrevia RG-hidrolasa. La enzima hidroliza la unión AGA-Ram en el esqueleto principal del RG. Más recientemente se han descripto otras enzimas que degradan RG: RG-liasa, que corta la unión Ram-AGA del esqueleto principal y dos enzimas que actúan en forma exo: RG-ramnohidrolasa, que remueve una Ram terminal del extremo no reductor del RG, y RG-galacturonanohidrolasa, que remueve AGA terminal del extremo no reductor de RG 49_.

1.3.2.3 Enzimas que degradan las cadenas laterales de los polímeros pécticos y remueven sustituyentes de la cadena principal (enzimas accesorias).

Estas están involucradas en la degradación de las ramificaciones o en la desesterificación de la pectina y se han denominado enzimas accesorias. Algunas de estas enzimas actuarían también sobre otros polisacáridos constituyentes de la pared celular, en particular la hemicelulosa, dependiendo el enlace específico que la enzima

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reconoce. La mayor parte de las enzimas auxiliares o accesorias se han estudiado en bacterias y hongos filamentosos, en particular los del género Aspergillus 60. Entre las

enzimas accesorias tenemos:

1.3.2.3.1 -L-Arabinofuranosidasas (EC 3.2.1.55) y arabinoxilanohidrolasa (EC

3.2.1.55): las primeras son más bien inespecíficas y remueven residuos Ara unidos por enlaces -1,2-, -1,3- y -1,5- de diversos sustratos, entre ellos los arabanos laterales de las pectinas. La segunda es muy específica de residuos Ara unidos a xilosa y es una enzima involucrada en la degradación de la hemicelulosa.

1.3.2.3.2 Endo-arabinasas (EC 3.2.1.99): hidrolizan en forma aleatoria las uniones -

1,5 de los arabinanos, potenciando la acción de las arabinofuranosidasas.

1.3.2.3.3 - y -Galactosidasas (EC 3.2.1.22 y EC.3.2.1.23): remueven residuos Gal

de los galactanos laterales de las pectinas.

1.3.2.3.4 Endo- y exo-galactanasas (EC 3.2.1.164 y EC. 3.2.1.145): junto a la -

galactosidasas, son requeridas para la degradación completa de las cadenas laterales de galactano y arabinogalactano presente en las pectinas. Si bien los enlaces presentes en estas estructuras son del tipo -1,3-, -1,4- o -1,5-, la mayoría de las endo-galactanasas estudiadas muestran preferencia por las uniones -1,4. La única exo-galactanasa descripta libera Gal de galacto-oligosacáridos y posee actividad transferasa.

1.3.2.3.5 Feruloil- y p-coumaril-esterasas (EC 3.1.1.73): estas enzimas remueven los

residuos feruloíl- y coumaroíl- que se encuentran esterificando al O-5 en xilanos y al O-3 en Ara u O-6 en Gal de las pectinas. Debido a la propiedad de estos residuos de producir entrecruzamiento entre la pectina y xilano con los otros polisacáridos de la pared como lignina, la acción de estas enzimas es importante para la integridad de la pared. Están muy difundidas en bacterias y hongos filamentosos.

1.3.2.3.6 Acetil- y metil-esterasas (EC 3.1.1.6 y EC 3.1.1.11): las pectin acetil o metil

esterasas remueven grupos acetilo y metilo de la región del HG, y han sido encontradas en plantas superiores, numerosos hongos filamentosos, levaduras y bacterias. También se ha descripto una ramnogalacturonano acetil esterasa que remueve acetilos del RG y es esencial para la acción de la RG-hidrolasa. Otra esterasa muy estudiada es la acetil-xilano esterasa, que remueve los grupos acetilo que esterifican el O-3 de la cadena principal del xilano y facilita la degradación de este polímero por las endoxilanasas.

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1.3.2.4 Otras enzimas con acción sobre la pectina

Incluyen la galacturónico oxidasa o ácido urónico oxidasa, la cual oxida el AGA en presencia de oxígeno a ácido galactárico y H2O2; las transferasas que contribuyen a la

síntesis de los polisacáridos pécticos (se estima que se requieren más de 53 enzimas para llevar a cabo dicho proceso) y el conjunto de enzimas intracelulares responsables del metabolismo de los ácidos urónicos y otros. El papel exacto de la oxidasa no ha sido descripto, pero se postula que está involucrada en la modificación de componentes de la pared celular vía oxidación del AGA como defensa del vegetal 61_.

Aún no ha sido descripta esta enzima en microorganismos.

Figura 1.5: Polímeros estructurales de la pectina y sitio de ataque de las pectinasas 49.