Estrategias de clonado de pg

4.2.7.1 Estrategia de clonado de pg1 con intrón en PYES 2 4.2.7.1.1 Clonado del gen pg1 en pYES2

El producto de PCR (pg1) y pYES2 fueron digeridos con EcoRI y BamHI. El plásmido

fue tratado además con fosfatasa alcalina a los efectos de evitar su recirculación. Luego de ser purificado mediante el sistema de ADN Purification kit illustra™ MicroSpin Columns (GE Healthcare), el gen pg1 fue ligado al vector pYES2 con ADN

ligasa T4 (Promega) durante 16 h a 37°C, generándose el plásmido recombinante pYES2:pg1 (Figura 4.3).

4.2.7.1.2 Transformación y selección de clones positivos E. coli TOP10F .

Las células de E. coli TOP10F competentes se transformaron con el plásmido

recombinante pYES2:pg1 como se detalla a continuación: Se incubó una mezcla

compuesta por 90 µl de E. coli competentes39 y 5 µl de pYES2:pg1 en baño de

agua/hielo por 30 min, luego a 42ºC por 15 min y finalmente en agua/hielo por 2 min. Luego se agregaron 850 µl de medio LB a esta mezcla para ser reincubada a 37ºC por 45 min. Finalmente, esta mezcla fue centrifugada por 10 min a 10.000 g y el pellet fue sembrado en placas de Petri conteniendo agar LB suplementado con ampicilina (100 µg/ml). Estas placas fueron incubadas ON a 37ºC. Las colonias obtenidas fueron analizadas por colony PCR39_.

Figura 4.3 Esquema representativo de la estrategia de clonado del gen pg1 con el intrón en

pYES2. pYES2:pg1 6991 pb pYES2 5856 pb pg1 A. kawachii 1160 pb

=! "

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4.2.7.1.3 Comprobación del marco abierto de lectura

Los plásmidos de los clones positivos (G1-G14) fueron extraídos39 _{y luego fueron}

secuenciados a partir del extremo 5´ utilizando el T7 promoter/priming (Automatic Sequencer 3730xl (MACROGEN Corp., Corea)).

4.2.7.1.4 Transformación y selección de clones positivos S. cerevisiae INVSc1

Células electrocompetentes de S. cerevisiae INVSc1 fueron electroporadas con ADN

plasmídico proveniente de los clones G11 y G1245_{. Las colonias obtenidas fueron}

analizadas por colony PCR46_.

4.2.7.1.5 Expresión de pg1 en pYES2

La inducción fue llevada a cabo en dos clones (1 y 3) de S. cerevisiae INVSc1 según

protocolo del fabricante (Invitrogen). Se estudió la expresión de la PG1 recombinante durante 50 h, tanto en el sobrenadante como en el citoplasma.

4.2.7.2 Estrategia de clonado de pg1 sin intrón en PYES2

4.2.7.2.1 Generación del inserto pg1 sin intrón

La enzima PfIMI fue seleccionada para esta estrategia y fueron diseñados los primers PGIsI: 5´ACTCCCAGGTGGTGGTTCCCTCAAAGGTGACGGTGGTGCCATCGTTG 3´; formado por 17 bases del extremo 3´ del primer exón y 30 bases del extremo 5´ del segundo (incluyendo la secuencia diana de PfIMI: 5´CCANNNNNTGG 3´) y PG1intrv 5´GGTGGTGCCATCGTTGAGGTCCTTCAAGTT 3´; formado por bases del extremo 3´ del primer exón). Se amplificó el primer exón utilizando el pYES2:pg1 como molde (obtenido por medio de PureYield™ Plasmid Midiprep System, Promega, según indicaciones del fabricante), el primer PG1fw (con la secuencia BamH1) y el primer PG1intrv. La amplificación fue realizada en las condiciones que se detallan a continuación: 95ºC 180 s., 30× [95°C 60 s, 56ºC 30 s, 72ºC 60 s] 72ºC 300 s.

El fragmento obtenido fue purificado mediante DNA Purification kit illustra™ MicroSpin Columns (GE Healthcare), y reamplificado utilizando los primers PGIfw y PGIsI y las mismas condiciones de reacción. El producto de PCR fue visualizado por medio de electroforesis en gel de agarosa al 3 %.

4.2.7.2.2 Clonado del fragmento en PYES2

El producto de amplificación obtenido se digirió con BamH1 y PfIMI (según las indicaciones del fabricante). Por otro lado, se digirió pYES2:pg1 con las mismas

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fue purificado, tratado con fosfatasa alcalina y ligado al primer exón utilizando Ligasa T4.

4.2.7.2.3 Transformación y selección de clones positivos de E. coli TOP10F .

El plásmido obtenido (sin intrón), denominado pYES2:pg1 I, fue utilizado para

transformar células competentes de E. coli TOP 10´ tal como fue detallado en

4.2.7.1.2.

4.2.7.2.4 Comprobación de eliminación del intrón y del marco de lectura abierto

De los clones obtenidos, 10 fueron seleccionados al azar a los efectos de verificar que el intrón haya sido extraído y que el marco de lectura resultante fuera el correcto. Para ello, los plásmidos fueron extraídos mediante Miniprep39 _{y utilizados como molde para}

una PCR utilizando los primers PG1fw y PG1rv en las condiciones de reacción detalladas en 4.2.7.2.1. El producto de PCR fue digerido con la enzima PF1M1 y visualizado mediante electroforesis en gel de agarosa al 3 %. De los clones que resultaron positivos por PCR y restricción, 5 fueron seleccionados para secuenciar a partir del extremo 5´ utilizando el T7 promoter/priming (Automatic Sequencer 3730xl (MACROGEN Corp., Corea)).

4.2.7.2.5 Transformación y selección de clones positivos S. cerevisiaeINVSc1

Los plásmidos de las cepas seleccionadas que presentaron el marco de lectura correcto, fueron extraídos por MIDIprep y utilizados para transformar células competentes de S. cerevisiae INVSC145. Las colonias obtenidas fueron analizadas por

medio de colony PCR46

4.2.7.2.6 Expresión de pg1 I en pYES2

La inducción fue llevada a cabo en dos clones (3 y 5) de S. cerevisiae INVSc1 según

protocolo del fabricante (Invitrogen). La expresión de la PG1 recombinante fue estudiada durante 40 h midiendo actividad enzimática tanto en el sobrenadante como en el citoplasma.

4.2.7.3 Estrategia de clonado de pg1 I en p416 y p426

4.2.7.3.1 Digestión de pg1 I, p416 y p426 y clonado

El plásmido pYES2:pg1 I fue sometido a restricción por medio de las enzimas BamH1

y EcoR1 según indicaciones del fabricante a los efectos de obtener el gen de pg1 sin

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coli Top 10 F´ por medio de Miniprep39, se digirieron con las mismas enzimas de

restricción y se trataron con fosfatasa alcalina. Los productos de restricción fueron purificados mediante DNA Purification kit illustra™ MicroSpin Columns (GE Healthcare), y visualizados por medio de electroforesis en gel de agarosa al 1 %. Los productos de restricción fueron ligados con Ligasa T4 (Promega) según indicciones del fabricante.

4.2.7.3.2 Transformación y selección de clones positivos E. coli TOP10F .

Se transformaron células de E. coli TOP10F con los plásmidos recombinantes

p426:pg1 I y p416:pg1 I como se detalló en 4.2.7.1.2 y las colonias obtenidas fueron

analizadas por colony PCR39

4.2.7.3.3 Comprobación del marco abierto de lectura

Los plásmidos de los clones positivos para colony PCR fueron secuenciados a partir del extremo 5´ utilizando el T7 promoter/priming (Automatic Sequencer 3730xl (MACROGEN Corp.)).

4.2.7.3.4 Transformación y selección de clones positivos de S. cerevisiae INVSc1

Se electroporaron células electrocompetentes de S. cerevisiae INVSc1 con ADNs

plasmídicos provenientes de clones de E. coli45. Las colonias obtenidas fueron

analizadas por colony PCR.46

4.2.7.3.5 Expresión de pg1 en p416 y p426

La expresión fue llevada a cabo en dos clones de S. cerevisiae INVSc1 según

protocolo del fabricante (Invitrogen), pero sin el paso de inducción por galactosa, ya que se trata de plásmidos constitutivos. Se estudio la expresión de la PG1 recombinante durante 40 h tanto en el sobrenadante como en el citoplasma.