Clonación y deleción de los genes CaENG1 y CaENG2

El planteamiento de la clonación de nuevos genes que codificaran β-glucanasas en C. albicans implicaba ciertas dificultades.

La posibilidad de conseguir nuevos mutantes por métodos convencionales -partiendo de estirpes xog1- e intentar su complementación fenotípica mediante transformación con genotecas de DNA era una alternativa laboriosa, puesto que las cepas xog1 siguen presentando una actividad glucanasa residual detectable que podría dificultar dicha aproximación (González Garcés et al. 1997). La utilización de la purificación bioquímica y posterior secuenciación del extremo aminoterminal era, creíamos, técnicamente más compleja y larga. Por ello, se optó por una aproximación bioinformática basándonos en la supuesta similitud de dichas proteínas. El alineamiento de las secuencias aminoacídicas de las glucanasas codificadas por los genes ScENG1, ScENG2 y eng2+ ponía de manifiesto la existencia de varios bloques de elevada similitud entre las tres proteínas y con ello, la posibilidad de la utilización de la PCR en la búsqueda de nuevas enzimas hidrolíticas de glucano en C. albicans. De hecho, esta aproximación había sido utilizada con éxito en la clonación del gen ScENG1 (Baladrón García 1997) y, más recientemente, en la de seis genes que codifican exo-β-1,3-glucanasas en levaduras no convencionales con interés bien de tipo biotecnológico (Esteban et al. 1999) o clínico (Vázquez de Aldana et al. 2001). Finalmente esta estrategia permitió la clonación del gen CaENG1 (Dr. Pedro Felipe Esteban. Instituto de Microbiología y Genética. Universidad de Salamanca). La disponibilidad del genoma de este microorganismo durante el transcurso de está tesis (www-sequence.stanford.edu/group/Candida/) permitió la identificación de un fragmento de DNA que por su elevada homología con el gen ScENG2 fue denominado CaENG2 (Dr. Francisco del Rey. Instituto de Microbiología y Genética. Universidad de Salamanca).

Con el fin de elucidar la función biológica de los genes CaENG1 y CaENG2 de C. albicans, se procedió a su deleción, empleándose para ello el sistema habitual descrito por Fonzi e Irwin utilizando la casete hisG-URA3-hisG (Fonzi and Irwin 1993), el más utilizado hasta el momento (de Backer et al. 2000). Mientras que CaENG1 fue delecionado con relativa facilidad, ello no pudo obtenerse para CaENG2 en el fondo genético silvestre de la cepa CAI4 (tras el análisis de más de 60 clones analizados) pero sí en el fondo mutante Caeng1∆. Este resultado sugería que nos encontrábamos, a priori, con un gen esencial en una cepa silvestre, aunque no lo fuera en un fondo Caeng1∆.

Este hecho era relevante y potencialmente muy interesante por cuanto sugería la existencia de un cierto grado de interrelación funcional entre ambas actividades

enzimáticas. Sin embargo, las conclusiones a extraer son dependientes del grado de recombinación homóloga entre el DNA donador y receptor y ello tiene lugar de forma muy variable en C. albicans. Así, la frecuencia con la que el proceso de deleción se lleva a cabo correctamente por recombinación homóloga, frente a aquellos casos en los cuales la construcción se integra en otra región del genoma, es muy variable. Esto ocurre tanto en el primer alelo, con unos porcentajes que oscilan entre el 100 % y el 15 %, como en el segundo alelo, (porcentajes entre el 60 % y el 7 %). Así, por ejemplo, estos datos fueron 40 % para el primer alelo y 20 % para el segundo alelo en el gen MKC1 (Navarro-García et al. 1995), 80 % para el primer alelo y 33 % para el segundo en el gen ADE2 (Fonzi and Irwin 1993), para BGL2 los porcentajes son del 33 % en el primer alelo y 7 % en el segundo (Sarthy et al. 1997), 15 % en el caso del primer alelo y 15 % en el segundo para el gen ARG5,6 (Negredo et al. 1997) y en la exoglucanasa XOG1 los porcentajes de recombinación homóloga corresponden a un 60 % para ambos alelos (González Garcés 1998). En nuestro caso, respecto a la integración de la construcción de deleción de CaENG1 en el locus adecuado, se obtuvieron 6 clones buenos de 6 analizados en el primer alelo del gen, y 2 clones buenos de un total de 6 analizados en el segundo alelo. En el proceso de deleción del gen CaENG2, la recombinación homóloga adecuada en el primer alelo del gen se dio en 2 clones de 6 analizados sobre la cepa CAI4 y en 3 clones de 6 analizados cuando la disrupción se realizó en el fondo genético ∆Caeng1. En el caso de la deleción del segundo alelo del gen en dicho fondo genético, se obtuvo 1 clon con los dos alelos del gen CaENG2 delecionados correctamente, de 6 clones analizados.

Esta variabilidad dificulta la extracción de conclusiones que permitan determinar el carácter esencial de un gen en este microorganismo y depende de características específicas de cada gen concreto, su localización cromosómica, su nivel de expresión o la longitud del DNA homólogo de las regiones flanqueantes de la casete de disrupción. También puede ser el resultado del polimorfismo existente en algunas cepas, por el cual un gen clonado puede diferir en parte de la secuencia del gen de la cepa hospedadora en alguno de sus alelos, o puede depender incluso del propio sistema o técnica de transformación (de Backer et al. 2000).

Para evaluar la posible esencialidad de CaENG2 en un fondo silvestre, reintegramos el gen CaENG1 en una cepa ∆eng1 ∆eng2. La obtención de transformantes CaENG1 ∆eng1 ∆eng2 en éste prácticamente descarta el hecho de que el gen CaENG2 sea esencial, aunque hay que tener en cuenta que el reintegrante es heterozigótico para el gen CaENG1 a diferencia de lo que ocurre en la cepa CAI4. Nuestros datos, por el contrario, sugieren explicaciones alternativas de tipo técnico al problema de la deleción genética. Por ejemplo, en la estrategia clásica se usa la misma construcción genética que se emplea en la deleción del primer alelo, por lo cual puede recombinar con el alelo ya interrumpido durante la segunda ronda de transformación. De hecho, esta recombinación puede ocurrir con una frecuencia más elevada que la que se dio en el primer alelo, probablemente debido a la presencia del fragmento hisG (de Backer et al. 2000) y con ello de mayor cantidad de DNA homólogo. Éste podría ser el motivo por el que no se ha logrado la deleción del segundo alelo silvestre del gen

CaENG2, aunque no es fácil entonces explicar el por qué sí se consiguió en el mutante ∆eng1 ∆eng2. En cualquier caso, ello sugiere la utilización de esquemas de interrupción alternativos en los cuales la construcción hisG-URA3-hisG tuviera una orientación opuesta a la usada en la primera transformación o construcciones en las cuales el gen URA3 fuera flanqueado con regiones diferentes. En nuestro laboratorio se han utilizado recientemente construcciones en las que se usan los genes bacterianos de resistencia a cloranfenicol (cat) y aminoglucósidos (aph) flanqueando este marcador.

Otras explicaciones alternativas sería la existencia de polimorfismo, como sucede para PHR1. En la deleción de dicho gen se utilizó el sistema tradicional para la primera copia, mientras que se optó por una estrategia de integración y expulsión (“pop- in/pop-out”) en el caso de la segunda copia (Saporito-Irwin et al. 1995), debido a la dificultad de obtener cepas homocigóticas cuando se utilizaba la misma construcción para ambos alelos. La explicación sugerida a este fenómeno se basa en diferencias alélicas existentes en el locus PHR1, que fueron detectadas por el polimorfismo presentado para algunas enzimas de restricción. Según esto, diferencias en los extremos del DNA transformante con respecto a una de las copias genómicas del locus podrían dificultar la recombinación en esa copia frente a su integración en otro alelo (el cual es igual al DNA transformante), aunque éste ya se haya interrumpido previamente (de Backer et al. 2000). Aun cuando podría tratarse de un fenómeno de polimorfismo, hay que tener en cuenta que ha sido posible la deleción del segundo alelo del gen en otro fondo genético, por lo cual no parece ser éste el problema.

Finalmente, la interrupción del gen XOG1, tanto en un fondo genético ∆eng1 como en un fondo genético ∆eng1 ∆eng2, parecía interesante por la posibilidad que nos brindaba de abordar desde otra perspectiva el papel de CaENG1 y CaENG2 en C. albicans. El mutante nulo xog1 fue obtenido en nuestro laboratorio (González Garcés et al. 1997) y la comprobación de la interrupción correcta de los dos alelos del gen XOG1 podía realizarse fenotípicamente, gracias a la capacidad de Xog1p de hidrolizar el sustrato fluorogénico MUG liberando metilumbeliferona, compuesto que se detecta por la fluorescencia que emite tras su excitación con luz ultravioleta. En el proceso de interrupción, el porcentaje de transformantes en los que se había producido recombinación homóloga fue de un 50 % en el primer alelo y de un 20 % en el segundo, inferiores a los descritos (González Garcés 1998).

Todas las caracterizaciones fenotípicas se realizaron empleando como control la cepa de referencia CAF2; y en algunos casos la cepa silvestre SC5314. Las estirpes mutantes empleadas en los ensayos son heterocigóticas para el gen URA3: xog1, ∆eng1, ∆eng1 xog1, ∆eng1 ∆eng2 y ∆eng1 ∆eng2 xog1; y en algunos casos, se utilizaron también cepas que llevan el gen CaENG1 reintegrado, bien en su región cromosómica (como en el caso de las estirpes ENG1 ∆eng1 xog1 y ENG1 ∆eng1 ∆eng2), bien en el gen LEU2 bajo la expresión del promotor del gen de la actina ACT1 (Delbruck and Ernst 1993), un promotor fuerte y constitutivo que permitiría la sobreexpresión de CaENG1 (ACT1PR ENG1 ∆eng1 xog1). La reintroducción del gen de interés en la cepa mutante que carece del mismo es fundamental para comprobar que

los fenotipos observados en la cepa delecionada son debidos a la ausencia del gen en cuestión y no a otros fenómenos.