osmolaridad. El aumento de osmolaridad externa es detectado, al menos, por dos osmosensores, Sln1p y Sho1p, que median la activación de Pbs2p (MAPKK) y Hog1p (MAPK) (Figura 7) (Maeda et al. 1995), aunque el papel del Sho1 como osmosensor se ha puesto en entredicho y parece realmente constituir un estructura adaptadora en la transmisión de la señal (Posas and Saito 1997; Reiser et al. 1999). También existen evidencias de la participación de esta cascada en la degradación del β-glucano. El gen PBS2 en multicopia o la deleción del gen PTC1, una fosfatasa cuyo producto regularía negativamente dicha ruta, confieren resistencia a la toxina killer K1 de una cepa sensible a la misma; en estas condiciones, tanto los niveles de mRNA de EXG1 como la actividad correspondiente son mayores. Por esta razón, parece ser que el fenotipo de resistencia a la toxina killer es debido a un incremento en la actividad de la proteína codificada por EXG1, hecho que sugiere que este gen es uno de los responsables de la reestructuración del β-1,6-glucano, polímero al que parece unirse la toxina killer de S. cerevisiae (Jiang et al. 1995). Por el contrario, la deleción del gen PBS2 provoca un descenso de los niveles de mRNA de EXG1 y de la actividad correspondiente y, consecuentemente, un ligero aumento en el nivel de β-1,6-glucano y un fenotipo de hipersensibilidad a la toxina killer. El hecho de que en cepas que llevan el alelo nulo del gen EXG1 se suprima sólo parcialmente el fenotipo de resistencia a la toxina killer observado por sobreexpresión de PBS2 o interrupción de PTC1 en estirpes silvestres para EXG1, sugiere que deben existir otros genes implicados en la dinámica de la pared celular que estarán, de alguna forma, regulados por la ruta Pbs2p-Hog1p. Estos genes podrían ser, por ejemplo, otras glucanasas o genes necesarios para la biosíntesis del β-glucano.
Adaptación a estres osmótico Estres osmótico Hog1 Sln1 Ypd1 Ssk1 Sho1 Ssk2 Ssk22 Ste11 Factor de transcripción Ste20 Ste50 Pbs2
Adaptación a estres osmótico Estres osmótico Hog1 Sln1 Ypd1 Ssk1 Sho1 Ssk2 Ssk22 Ste11 Factor de transcripción Ste20 Ste50 Pbs2 Figura 7: Ruta de respuesta a choque osmótico o ruta HOG.
II. ENZIMAS HIDROLÍTICAS DE LA PARED CELULAR: GLICOSIDASAS.
La pared celular fúngica es una estructura muy dinámica, siendo necesaria la existencia de un equilibrio entre las rutas de síntesis y de degradación para que se mantenga la viabilidad y sea posible realizar los diferentes procesos morfogenéticos. Aunque los mecanismos implicados en dichos procesos no han sido determinados en su totalidad, parece claro que la incorporación de nuevo material requiere fenómenos que degraden la pared previamente sintetizada mediante las denominadas enzimas líticas, hidrolasas con especificidad sobre alguno de los enlaces β-glicosídicos de los componentes de la pared celular. Todas las glicosidasas estudiadas hasta el momento son glicoproteínas que se secretan hacia el exterior y se localizan en el espacio periplásmico o quedan asociadas a la pared celular (Cid et al. 1995).
Quitinasas.
La quitina, como ya ha sido descrito, es un componente minoritario de la pared celular que se deposita específica y mayoritariamente en la región del septo y que es importante para la estabilidad mecánica de esta unión temporal entre la célula madre y la célula hija. La degradación de este septo es fundamental para permitir que la célula hija comience una vida independiente. Hasta el momento, se ha detectado una única endoquitinasa en S. cerevisiae, que es una enzima periplásmica cuya actividad es mayoritariamente secretada al medio cuando las células crecen en un medio rico en nutrientes como YPD (Elango et al. 1982). El gen responsable de esta actividad es CTS1 (Kuranda and Robbins 1987; Kuranda and Robbins 1991). El pequeño porcentaje de actividad endoquitinasa que queda asociado a la pared celular parece ser el responsable de la degradación del septo durante la citoquinesis, ya que la disrupción de CTS1 impide que las células se separen, originándose grandes agregados celulares. Estudios realizados con células sincronizadas muestran que la expresión de CTS1 es periódica y que la transcripción del gen está regulada por Ace2p, un factor de transcripción con dedo de zinc. Mutantes ace2 muestran un defecto en la separación celular (ver Cid et al. 1995; Orlean 1997).
En C. albicans se han clonado tres genes que codifican para proteínas con actividad quitinasa, CaCHT1, CaCHT2 y CaCHT3 (McCreath et al. 1995; McCreath et al. 1996). Los tres genes presentan una notoria similitud con otros genes de quitinasas descritos. La transcripción de CaCHT2 y CaCHT3 es mayor cuando C. albicans se encuentra en fase de levadura que en fase micelial. No ha podido detectarse el tránscrito de CaCHT1 en ninguna de las fases citadas. Posteriormente se observó que CaCht1p carece de la región rica en serina y treonina característica de las otras quitinasas de C. albicans (McCreath et al. 1996). Muy recientemente se han delecionado los genes CaCHT2 y CaCHT3 y se ha sobreexpresado CaCHT2 para
estudiar el papel de estas enzimas en los procesos morfogenéticos (Pallotti et al. 2000).
Mananasas.
La información disponible respecto de un sistema responsable de la hidrólisis de los polímeros integrantes de la pared celular que contienen manosa es muy limitada. Varios investigadores han llevado a cabo una purificación parcial de una α-manosidasa no específica en S. cerevisiae, que es activa frente al sustrato p-nitrofenil-α-manopiranósido. Esta actividad se ha descrito como un componente de la membrana vacuolar. El gen estructural de esta actividad es AMS1 (Kuranda and Robbins 1987). Los mutantes ∆ams1 presentan un crecimiento vegetativo y una capacidad de esporulación semejantes a una cepa silvestre. Experimentos realizados con cepas silvestres haploides AMS1, cepas ∆ams1 y con manosa tritiada sugieren que la α-manosidasa podría jugar un papel importante en el metabolismo de las glicoproteínas, catalizando la hidrólisis secuencial de residuos de manosa del extremo no reductor de las cadenas de manano (revisado por Cid et al. 1995).
Glucanasas.
Como se mencionó anteriormente, el β-glucano constituye el principal polisacárido responsable del mantenimiento de la forma y de la rigidez de la pared celular de las levaduras. Aunque los glucanos de la pared no presentan un recambio apreciable durante el crecimiento de estos microorganismos, probablemente exista una hidrólisis dirigida, limitada y finamente regulada de estos polímeros por β-glucanasas endógenas durante ciertos procesos morfogenéticos como la gemación, el crecimiento de la pared, la conjugación, la esporulación y la transición morfológica.
Las β-glucanasas han sido estudiadas en numerosas levaduras. Según su modo de acción sobre el polímero, exo o endohidrolítico, se pueden clasificar como exoglucanasas o endoglucanasas. Las primeras actúan sobre los enlaces β-O-glicosídicos terminales del extremo no reductor de la molécula de sustrato, originando glucosa como producto final único de la hidrólisis del polímero; las endoglucanasas, por su parte, hidrolizan los enlaces internos de la cadena de β-glucano liberando una mezcla de oligosacáridos (Figura 8). Respecto a la especificidad, la mayoría de las exoglucanasas son capaces de hidrolizar tanto enlaces β-1,3 como enlaces β-1,6, aunque estos últimos con menor eficiencia. La actividad exo-β−1,3-glucanasa se pone de manifiesto al ser analizada mediante la utilización de sustratos como laminarina (sustrato lineal de β-1,3-glucano), MUG (4-metilumbeliferil-β-D-glucopiranósido) y el derivado sintético pNPG (paranitrofenil--β-D-glucopiranósido) (Cenamor et al. 1988; Farkas et al. 1973). La actividad exo-β−1,6-glucanasa se puede evidenciar empleando pustulán, un sustrato lineal de β-1,6-glucano (Cenamor et al. 1988). Las endoglucanasas, por el contrario,
exhiben una marcada especificidad en cuanto al enlace a hidrolizar, conociéndose tanto β-1,3 como β-1,6-endoglucanasas; la actividad endohidrolítica se puede poner de manifiesto mediante la utilización de laminarina oxidada (Cenamor et al. 1988).
O H O O H O O H O H O O H O O O H O H O O H O O O H O O H O H O O H O O HO H O HO O H OH EXO-β-1,6 EXO-β-1,3 ENDO-β-1,3 ENDO-β-1,6 O H O O H O O H O H O O H O O O H O H O O H O O O H O O H O H O O H O O HO HO H O H O HO HO O H OH OH EXO-β-1,6 EXO-β-1,6 EXO-β-1,3
EXO-β-1,3 ENDO-ENDO-β-1,3β-1,3
ENDO-β-1,6 ENDO-β-1,6
Figura 8: Actividad exo y endo hidrolítica de las glucanasas.
El potencial hidrolítico mejor estudiado corresponde a S. cerevisiae, que presenta varias formas bien caracterizadas con actividad glucanásica en las distintas fases de su ciclo biológico (revisado por Cid et al. 1995; Orlean 1997). Durante el ciclo vegetativo de esta levadura se detectan tres glicoproteínas con capacidad para hidrolizar β-glucanos,. Dos de ellas presentan actividad exo-hidrolítica (Farkas et al. 1973) y han sido denominadas minoritaria o ExgIa y mayoritaria o ExgIb por su abundancia relativa. Poseen la misma fracción polipeptídica, distinguiéndose por su contenido en carbohidratos que representa el 11-14 % de peso seco en la forma más abundante (ExgIb) y alrededor del 40 % en la forma minoritaria (ExgIa) (Nebreda et al. 1987; Ramirez et al. 1989). La tercera β−glucanasa detectable en el medio de cultivo presenta actividad endohidrolítica únicamente frente a enlaces β-1,3 (Farkas et al. 1973). Usando mutantes que carecen de las exoglucanasas mencionadas (ExgIa y ExgIb), se identificaron dos enzimas capaces de hidrolizar glucano que eran detectadas sólo en lisados de protoplastos pero no en extractos celulares y en sobrenadantes de cultivo. Ambas poseen carácter exohidrolítico (Cenamor et al. 1987). La esporulación, por su parte, comporta un drástico aumento en la actividad β-1,3-glucanásica presente en extractos celulares. Este incremento es debido mayoritariamente a la inducción de una nueva forma enzimática con actividad exo-β−1,3-glucanásica, (del Rey et al. 1979; del Rey et al. 1980; San Segundo et al. 1993).