PORCENTAJE DE RECUPERACIÓN
100,53% 100,01% 98 % - 102 %
COEF. VARIACIÓN 1,3795 % 0,4880 % < 5 %
T DE STUDENT 1.1526 0.0068 < 2.306*
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IV. DISCUSION
La validación de un método analítico se mide con los parámetros que sean evaluados para el proceso; estos serán dependientes directos de la naturaleza del método y las especificaciones con las que se debe cumplir. En el método validado en el presente trabajo, esta clasificado como un método de determinación cuantitativo, a los que corresponden evaluar Linealidad, Precisión, exactitud y sensibilidad; sin embargo las características señaladas como requeridas puedan ser no necesarias y viceversa; así tenemos que la sensibilidad es un parámetro del análisis cuantitativo para niveles bajos de compuestos, es decir se emplea cuando se realizan determinaciones de analitos a nivel de trazas, no siendo este el caso no se realizó la aplicación en el proceso 5,13.
En la tabla 1 se presentan los resultados obtenidos de la comparación entre el uso de 1000 uL y 500 uL de reactivo ; se realizaron 10 determinaciones con cada uno : 1 mL de Reactivo frente a 20 uL de muestra y 500 uL de Reactivo frente a 10 uL de muestra, bajo las mismas condiciones de reacción indicadas en el inserto y para ambos niveles (normal y patológico); en la aplicación de la prueba t de student, se obtuvo 2,137 y 1,173 nivel 1 y 2 respectivamente, siendo estos menores al valor crítico: 2,228 (0.05; 10); por tanto, no existe diferencia significativa y se puede aplicar la reducción sin afectar el resultado final 14.
En la tabla 2, se muestran los parámetros que evalúan la linealidad del método; para ello se analizaron las siguientes concentraciones: 50 %, 100 % y 150 %, luego de efectuar los cálculos se determinó que el método presenta la capacidad de brindar resultados linealmente proporcionales a la concentración
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del analito en estudio. El coeficiente de correlación, nos indica el grado de relación entre la concentración (x) y la respuesta (y), se obtuvo un coeficiente de correlación de 0.997 y 0.998 nivel 1 y 2 respectivamente, y tenemos que en las tablas de r para n-2 gl (8; 0.005) es 0.990, los valores obtenidos aceptan una correlación positiva con una probabilidad superior al 95 %. La pendiente b o coeficiente de regresión está relacionada con la sensibilidad del método, de tal forma que a mayor pendiente mayor sensibilidad (respuesta del analito frente a los cambios de la concentración del analito); esto se observa en los gráficos 1 y 2.8, 12.
En la tabla 3, tenemos la aplicación del test de linealidad de la pendiente, se obtuvo un texp de 34,053 y 43,415 nivel 1 y 2 respectivamente, que es mayor al
ttabla(n - 2 gl) que es de 2,3646 con un nivel de confianza del 95 %, este valor es
tan alto que indica que la probabilidad de que la pendiente “b” sea diferente de cero es muy elevada. También se determinó que cumplen con las especificaciones del coeficiente de variación: 1,3787 % y 0,4758 % nivel 1 y 2; deben ser < 5 %. Sin embargo no son suficientes para demostrar la linealidad del método, sino que además se demostró mediante el empleo de un Test de linealidad, siendo uno de los más confiables la prueba t de student, utilizada para determinar la significancia estadística de la varianza de la pendiente b, la aplicación demostró que cumple con el criterio de linealidad, pues el valor del texp
(34,0539 y 43,4153 nivel 1 y 2 respectivamente, es mayor al ttab (2.228).
En la tabla 4, para determinar la precisión del método, se evaluó la repetibilidad, que se define como el grado de concordancia entre los valores de una serie repetida de ensayos analíticos efectuados sobre una muestra homogénea por un mismo analista bajo la mismas condiciones, es decir, la
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capacidad de un método para dar resultados semejantes cuando se aplica a una muestra; para ello se efectuaron 10 determinaciones para ambos niveles (normal y patológico), la precisión se expresa por la desviación Standard pero la mejor forma de medirla es mediante el coeficiente de variación, se obtuvo 2,0384 % y
0,8572 nivel 1 y 2, respectivamente, lo cual nos indica que cumple con el criterio de precisión (CV <5 %). En la determinación de la Precisión intermedia se efectuaron 10 mediciones similares a los efectuados para la repetibilidad (antes descritas), definida como la medida de la precisión de los resultados de un método analítico efectuado sobre la misma muestra homogénea pero con analistas diferentes. El Coeficiente de variación obtenido en el ensayo fue de
1,5780 % y 0,7260 % nivel 1 y 2; el cual es menor al establecido por la USP para este tipo validación (CV < 5 %). La precisión está relacionada con la dispersión de una serie de mediciones, pero no nos indica de lo cerca que esta del valor exacto, por ello podemos tener mediciones muy precisas pero poco exactas 16, 17.
En la tabla 5, se muestra el tratamiento estadístico aplicado para determinar la exactitud del método; que expresa la cercanía entre el valor teórico y el valor práctico obtenido al aplicar el análisis, se realizaron 3 concentraciones (50 %, 100 % y 150 %) por triplicado para cada uno de los niveles; si la diferencia entre el Valor Teórico y el práctico es grande revela la posible existencia de errores que deberían ser corregidos. El coeficiente de variación obtenido fue de: 1,3795 % y
0,4880 % (< 5 %); la exactitud se demostró con la aplicación del t de student con el 95 % de confianza y 8 gl, obteniéndose un valor de texp de 1.1526 y 0,0068
nivel 1 y 2, siendo éste menor al punto crítico 2.306 (ttabla), con la probabilidad de
cometer error de p = 0.05 y n – 1 gl; indicando que no existe diferencia significativa, por tanto el método es exacto 2, 10,17.
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V. CONCLUSIONES
Luego de haber aplicado los parámetros establecidos de validación del método
analítico para la determinación de amilasa, en el Laboratorio Quintanilla S.R.L se concluye lo siguiente:
El método es lineal en el intervalo de las concentraciones de 50% hasta el 150 % de la muestra
El método es preciso porque cumple la repetitividad (Nivel 1: C.V 2.0384 % y Nivel 2: 0.8572) y precisión intermedia (Nivel 1: C.V 1.5780 % y Nivel 2: 0.7260 %)
El método es exacto porque no hay diferencia significativa entre la recuperación media (Nivel 1: 100.53 % y Nivel 2: 100.01) y el 100 % teórico.
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VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0034751519960 00100009&lng=es&nrm=iso>. ISSN 0034-7515.
Consultado 16 de febrero del 2009
4. Castelluci, F.: “Recomendaciones Armonizadas para la validación de Métodos de Análisis (Informe Técnico)”. París. 2005. Pp: 5-6
5. Fernández, A ; Aguilera.: Validación de los Métodos Analíticos para la Identificación y Cuantificación del Dextrometorfano Jarabe. Revista Cubana de Farmacia. 2002. 36(1):28-34.
6. García H ; Aparici, M.: La formación como herramienta de la gestión de calidad. Industria Farmacéutica 2002 Julio / Agosto. Pp: 71 – 75.
7. Guía de Validación de Métodos Analíticos. Disponible en:
http://www.ministeriodesalud.go.cr/protocolos/guiavalidacionmetodosana liticos.pdf
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8. Guidelines for Collaborative Study - Procedures to Validate Characteristics of a Method of analysis, AOAC International, revised May 2002, publicado originalmente en J. Assoc. Off. Anal. Chem. 72, 694-704 (2000).
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10.Líneas directivas para evaluar y expresar incertidumbre en la medida NIST resultan ", NIST nota técnica 1297, 2001, el Instituto Nacional de Estándares y la Tecnología.
11.Organización Mundial de la Salud.: Curso de Gestión de Calidad para Laboratorios. Módulo 1, EE.UU. 2007. Pp: 4-6. Disponible en:
www.paho.org/Spanish/aad/tsh/ev/labs-CGC.htm. Consultado 17 de marzo del 2009
12.Organización Mundial de la Salud. : Comité de Expertos de la OMS en Especificaciones para las Preparaciones Farmacéuticas. 2003. 32º Informe, Anexo 5. Ginebra.
13.Organismo Argentino de Acreditación.: Guía para la Validación de Métodos de Ensayo. Argentina. 2003. Pp: 1 – 16. Disponible en:
http://www.oaa.org..ar/evaluadores/DC-LE-05.pdf Consultado 15 de marzo del 2009
14.Rodríguez, G ; Blanco, R.: “Aseguramiento de la calidad analítica y norma ISO 17 025 en laboratorios químicos y clínicos”. Rev. Costarricense de Ciencias Médicas. San José, Costa Rica. Vol. 22 (2). 2001. Disponible en: http://www.ia.csic.es/sea/revista/VOL36-34/03.pdf
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15.Taylor, J. : Validation of Analytical Methods. Analytical Chemistry, Vol. 55 (6). 2006. Pp: 12 – 15
16.Tapia, M.: Desarrollo y Validación de Metodologías Analíticas. Memoria de práctica para optar al título de Químico Farmacéutico. Santiago. Universidad de Chile.2003.
17.The United States PHARMACOPEA Convention. The United States PHARMACOPEA XXIX. 29º Edition. USA. 2006. Pp: 1436-1437, 3328-3331. 18.Winn-Deen, E.: DEVELOPMENT OF A DIRECT ASSAY FOR "-AMYLASE, Clin.
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ANEXO Nº I
I. CÁLCULOS PARA COMPARAR ENTRE EL USO DE 1000 uL y 500 uL DE RVO, SEGÚN PRUEBA t DE Student
a. Cálculo de la varianza (s2); Varianza combinada y t Student
1 ) ( 2 2 .
n x x sx y i 2 ) 1 ( ) 1 ( 2 1 2 2 2 2 1 2 , n n S n S n sx y 2 2 , 1 2 , 2 1 n S n S x x t y x y x T Student Punto crítico
NIVEL 1 2,137 < 2,228
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II. CÁLCULOS PARA DETERMINAR LA LINEALIDAD DEL MÉTODO
a. Cálculo de la recta de Regresión
Se determina la curva de regresión, sobre los puntos individuales y sin promediar
Para el caso de una recta la función toma la forma de la siguiente ecuación
a
bx
y
Tabla 1: Linealidad del método – NIVEL 1