Colección de ESTs: secuenciación y agrupamiento

La generación de ESTs es una aproximación eficiente para identificar el conjunto de genes que se expresa en un organismo (por ejemplo, da Silva et al, 2005; Newcomb et al, 2006; Terol et al, 2007). Con la finalidad de identificar genes expresados durante el desarrollo vegetativo en cítricos se generó una colección de ESTs a partir de la genoteca amplificada de cDNA procedente de tejidos vegetativos de Citrus clementina. Un total de 1,824 clones independientes de cDNA se aislaron al azar a partir de la genoteca Veg1 y se secuenciaron desde el extremo 5’. Tras el pre-procesado de las secuencias, 1,689 ESTs de alta-calidad que, adicionalmente, superaron 100 pb de longitud, se utilizaron para posteriores análisis (Tabla 5, Tabla Suplementaria IV). La longitud de dichas ESTs, comprendida entre 101 y 810 bases, con una longitud media de 542 bases, fue relativamente superior a los valores obtenidos en otros proyectos de secuenciación de ESTs como el de Populus con 470 pb (Sterky et al, 2004) o el de manzano con 468 pb (Newcomb et al, 2006). La distribución por tamaños de las ESTs mostró que la mayoría de ellas (82%) tenían una longitud igual o superior a 400 bases (Tabla Suplementaria IV).

El número combinado de contigs y singletons que resulta de un proceso computacional de agrupamiento o ensamblaje de ESTs constituye una estimación del número de genes únicos de un organismo de modo que a medida que el número de ESTs crece, el número de genes únicos deberá ser redefinido. Los 1,824 clones de la genoteca Veg1 fueron agrupados inicialmente en 703 contigs y 719 singletons cuando

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la colección de ESTs de cítricos del CFGP contaba con 22,635 ESTs (Forment et al, 2005). Dado que la colección de ESTs de cítricos del CFGP ha crecido considerablemente, en la actualidad contiene 85,965 ESTs agrupadas en 27,551 unigenes (11,844 contigs y 15,707 singletons), los resultados de este trabajo han sido redefinidos dado que consideramos que, pese al esfuerzo adicional que ello conlleva, suponen una mejor estimación del número de genes únicos. Así pues, las ESTs procedentes de la genoteca Veg1 se ensamblaron junto con el conjunto total de ESTs obtenidas en el CFGP (85,965 ESTs) de modo que del total de 1,689 ESTs de alta-calidad, 1,262 ESTs quedaron agrupadas en 971 contigs o conjuntos de secuencias formados por dos o más ESTs, mientras que las restantes 427 ESTs se clasificaron como singletons, pues no mostraron similitud con ninguna otra secuencia de la colección (Tabla 5, Tabla Suplementaria IV).

Tabla 5. Resumen de la colección de ESTs de la genoteca Veg1

Resultados de la secuenciación

Número de clones de cDNA aislados 1,824

Número de clones de cDNA secuenciados 1,771

Número de ESTs de alta-calidad 1,689

Longitud media de las ESTs 542 bases

Resultados del agrupamiento

Número de ESTs ensambladas 1,689

Número de contigs 971 Número de singletons 427 Número de unigenes 1,398 Redundancia 17% Unigenes únicos 439 Novedad 31%

La redundancia se ha estimado como [1- (Unigenes/ESTs) x 100] y la novedad como [Unigenes únicos/Unigenes) x 100]

La generación de una colección de ESTs constituye un método relativamente rápido y potente para la identificación de genes, para la confirmación de las regiones codificantes en secuencias genómicas, para el estudio de relaciones filogenéticas, para la estimación de los niveles de expresión de los genes de los que proceden y para el desarrollo de micromatrices de cDNA (Alba et al, 2004). Sin embargo, una colección de ESTs presenta ciertas limitaciones. Una de ellas es la generación de ESTs redundantes derivadas de los transcritos más comunes, lo que puede reducir la eficiencia de esta aproximación. Las 1,689 ESTs obtenidas de la genoteca Veg1

representaron 1,398 unigenes o posibles transcritos únicos (971 contigs y 427 singletons) de modo que la redundancia de esta genoteca fue del 17%.

Adicionalmente, la genoteca Veg1 aportó un total de 439 unigenes únicos a la colección del CFGP (valor obtenido añadiendo al número de singletons el número de

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contigs formados sólo por ESTs de la genoteca Veg1) lo que supone una novedad del

31%. Este valor es una estimación de la capacidad de la genoteca para aportar nuevos genes a la colección. El bajo nivel de redundancia obtenido, junto al porcentaje relativamente elevado de novedad, indican que el potencial de esta genoteca para aislar genes de cítricos no ha sido agotado en este trabajo, de modo que la genoteca Veg1 puede secuenciarse con más profundidad permitiendo la identificación de nuevos genes de Citrus clementina.

1.3. Anotación funcional de los unigenes

Muchos de los unigenes pueden ser asignados a una función en base a la similitud de secuencia con proteínas o genes, bien con una función demostrada o bien con posibles funciones basadas asimismo en la similitud de secuencia con otros genes conocidos. La asignación de una posible función a cada uno de los unigenes obtenidos a partir de la genoteca Veg1 se realizó comparando la secuencia consenso de cada unigen, mediante BLAST (Altschul et al, 1997), con las bases de datos de proteínas: TAIR pep y UniRef90 pep. Además se identificaron los motivos funcionales mediante una búsqueda HMMER utilizando la base de datos Pfam (ver Materiales y Métodos). En la Tabla 6 se muestra el número de unigenes con secuencias similares en las diferentes bases de datos según los distintos niveles de significatividad (valores E) considerados. La comparación con el conjunto completo de proteínas de Arabidopsis (TAIR pep) permitió asignar una posible función (basado en un valor E <10-5_{) al}

83.1% (1162) de los unigenes (Tabla 6, Anejo I). Los resultados de las búsquedas por similitud de secuencia obtenidos en cada base de datos consultada, se recogen, para cada unigen de la genoteca Veg1, en la Tabla Suplementaria V.

Tabla 6. Número de unigenes con secuencias similares en las tres bases de datos

consultadas a diferentes valores E

Nº total de unigenes con secuencia similar Sin secuencia Base de Datos

E < 10-5 _{E < 10}-20 _{E < 10}-50 _{E < 10}-100 _similar

TAIR pep 1,162 1,044 722 321 236

UniRef90 pep 1,184 1,061 743 339 214

Pfam 619 510 281 281 779

El análisis de los resultados obtenidos en la base de datos UniRef90pep nos permitió estimar que de los 1,398 unigenes de la genoteca Veg1, un 72.5% (1,013 unigenes) presenta una similitud de secuencia significativa (valor E <10-5_{) con}

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desconocida y un 15.3% (214 unigenes) no tiene similitud de secuencia con ninguna proteína de la base de datos utilizada (Fig. 11, Tabla Suplementaria V).

Fig. 11. Clasificación funcional general de los unigenes procedentes de la genoteca de

cDNA de tejidos vegetativos según los resultados obtenidos en la base de datos UniRef90 pep.

Este último grupo probablemente incluye genes específicos de cítricos, aunque también puede incluir secuencias no codificantes (UTRs), secuencias contaminantes de DNA o artefactos. La proporción de genes específicos de cítricos se estimó comparando las secuencias de estos 214 unigenes, mediante BLASTX, con la base de datos PlantTA (Childs et al, 2007; http://plantta.tigr.org), excluyendo de ella los datos procedentes de los géneros Citrus y Poncirus. Los resultados de este análisis (Tabla Suplementaria V) indican que, de los 1,398 unigenes obtenidos de Veg1, 172 (12.3%) no muestran similitud significativa con ninguna secuencia de plantas, por lo que podrían ser considerados específicos de cítricos.