Identificación de los genes preferentemente expresados en los tejidos

cítricos que codifican factores de transcripción de la familia MYB (A) y de las familias C2C2- Dof, C3HC4, bHLH, ERF, WRK y C2H2 (B).

2.4. Identificación de los genes preferentemente expresados en los tejidos reproductivos

La identificación de los genes diferencialmente expresados en los tejidos reproductivos se llevó a cabo siguiendo la misma metodología descrita en el apartado anterior. Los análisis SAM realizados permitieron identificar un total de 238 unigenes de cítricos (4% de los unigenes de CIT1) expresados diferencialmente en el conjunto

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de los tejidos reproductivos de cítricos estudiados (Tabla Suplementaria XXIV). El análisis de enriquecimiento funcional, realizado con el programa FatiGO (Al-Shahrour et al, 2004), de este grupo de genes respecto al conjunto de los unigenes representados en la micromatriz CIT1 mostró que las GO no redundantes de

‘desarrollo del carpelo’ (GO:0048440, p = 9·10-3_{) ‘biosíntesis de ácidos grasos’}

(GO:0006633, p = 4·10-2_{) y ‘transporte de lípidos’ (GO:0006869, p = 2·10}-3_{) estaban}

significativamente sobre-representadas en el conjunto de unigenes diferencialmente expresados en los tejidos reproductivos (Fig. 35).

Fig. 35. Ontologías génicas de la componente ‘proceso biológico’ sobre-representadas

en el conjunto de unigenes expresados diferencialmente en los tejidos reproductivos. La escala de color muestra el nivel de significatividad, considerando ontologías enriquecidas aquéllas cuyo valor p corregido es inferior a 0.05.

Las GO relacionadas con el desarrollo floral (Fig. 35) incluyeron los unigenes de cítricos implicados en especificar la identidad de los órganos florales como

agamous (AG, aCL2625Contig1), pistillata (PI, aC20007B02), sepallata 3 (SEP3,

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(SHP1, aCL4207Contig1) y crabs claw (CRC, C20019G10) (Tabla Suplementaria XXIV). Los patrones de expresión de estos genes en los distintos tejidos estudiados mostraron, como era de esperar, una expresión diferencial en el conjunto de los tejidos reproductivos (Fig. 36). Sin embargo, los patrones de expresión de otros genes implicados en el desarrollo floral (como apetala, leafy, cauliflower o terminal flower 1, entre otros) no pudieron ser evaluados porque estos genes no se encuentran representados en la micromatriz CIT1.

Fig. 36. Porcentaje de expresión en cada uno de los tejidos vegetativos analizados (lámina foliar, NA; nervio central de la hoja, NE; entrenudo, EN; peciolo, PE y raíz, RA) respecto al conjunto de los tejidos reproductivos para los siguientes genes de cítricos implicados en el desarrollo floral: AG (aCL2625Contig1), PI (aC20007B02), SEP3 (aCL176Contig1), SHP1 (aCL4207Contig1) y CRC (C20019G10).

Recientemente, se ha estudiado la expresión de los siguientes genes de cítricos implicados en la floración: leafy, apetala1, terminal flower 1, y diversos homólogos a flowering locus T (Nishikawa et al, 2007). Sin embargo, los genes implicados en especificar la identidad de los órganos florales como agamous, pistillata,

sepallata 3 y los relacionados con el desarrollo del carpelo como shatterproof 1 y crabs claw no habían sido identificados previamente en cítricos.

Adicionalmente, el análisis de enriquecimiento funcional mostró que las GO correspondientes a la biosíntesis de ácidos grasos y al transporte de lípidos estaban significativamente sobre-representadas en los tejidos reproductivos (Fig. 35; Tabla Suplementaria XXIV). La ontología génica de biosíntesis de ácidos grasos incluyó los genes CER1, que en Arabidopsis está relacionado con la fertilizadad del polen (Aarts et al, 1995) y JMT, cuya expresión es elevada en flores de Arabidopsis (Seo et al, 2001). La síntesis y el almacenamiento de lípidos son procesos de conocida importancia durante la microsporogénesis y el desarrollo del polen (Ferreira et al,

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1997), lo que resulta coherente con la sobre-representación de los genes implicados en la biosíntesis de ácidos grasos en los tejidos reproductivos de cítricos. La categoría de ‘transporte de lípidos’ incluyó, principalmente, genes que codifican proteínas de transferencia de lípidos (LTPs) (Tabla Suplementaria XXIV). Las LTPs constituyen un grupo de proteínas abundantes en plantas. La capacidad de unión de las LTPs con ácidos grasos y de transferencia de fosfolípidos entre membranas ha sido demostrada

in vitro pero su función biológica todavía no se conoce. Sin embargo, se ha sugerido

un posible papel en el ensamblaje de la cutina y las ceras y en la defensa de las plantas frente al ataque por patógenos (Arondel et al, 2000). La caracterización de la expresión de los miembros de la familia LTP en Arabidopsis ha mostrado una expresión elevada en flores (Clark y Bohnert, 1999; Arondel et al, 2000). La identificación de los unigenes de cítricos que codifican LTPs como diferencialmente expresados en tejidos reproductivos resulta consistente con los estudios de expresión realizados previamente en Arabidopsis.

Finalmente, en el conjunto de unigenes diferencialmente expresados en los tejidos reproductivos de cítricos se identificaron diversos TFs (Tabla Suplementaria XXIII). En la Figura 37 se muestran los valores de expresión, representados como porcentaje de expresión en cada uno de los tejidos estudiados (lámina foliar, nervio central y peciolo de la hoja, entrenudo y raíz) respecto a la expresión obtenida en el conjunto de los tejidos reproductivos, para 6 unigenes de cítricos que codifican TFs.

Fig. 37. Porcentaje de expresión en cada uno de los tejidos vegetativos analizados (lámina foliar, NA; nervio central de la hoja, NE; entrenudo, EN; peciolo, PE y raíz, RA) respecto a la expresión obtenida en el conjunto de los tejidos reproductivos para los siguientes genes de cítricos que codifican factores de transcripción de la familia NAC: aCL728Contig2 y aCL35Contig3; de la subfamilia MIF (aCL9040Contig1) y de la familia MYB: aC04018B08, aCL6070Contig1 y aCL7866Contig1.

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La familia MYB de TFs es una de las más extensas en plantas, con 198 miembros en Arabidopsis. En los últimos años, los genes de dicha familia MYB han sido implicados en diversos procesos fisiológicos y bioquímicos (Yanhui et al, 2006). Sin embargo, para muchos de los miembros de la familia todavía no se dispone de información funcional. La secuencia del unigen de cítricos aCL6070Contig1 fue similar a la del gen MYB21 (At3g27810) de Arabidopsis, especie en la que se ha demostrado que dicho gen codifica un TF específico de flor (Shin et al, 2002) y regula importantes aspectos de la respuesta a jasmonato durante el desarrollo de los estambres (Mandaokar et al, 2006). El unigen aCL7866Contig1 mostró una elevada similitud de secuencia con el gen MYB78 de Arabidopsis. La función de dicho gen aún no ha sido estudiada, pero los patrones de expresión obtenidos en nuestro trabajo muestran una clara expresión diferencial en tejidos reproductivos de cítricos. La secuencia del unigen aCL9040Contig1 fue similar al gen MIF2 de Arabidopsis, cuya expresión es elevada en flores y frutos (Hu y Ma, 2006). La identificación de nuevos TFs diferencialmente expresados en los tejidos reproductivos supone la base para el estudio de su posible papel en la regulación del desarrollo reproductivo en cítricos.

2.5. Identificación de los genes preferentemente expresados en los tejidos vegetativos

La identificación de los genes de cítricos con expresión diferencial en tejidos vegetativos se realizó mediante dos tipos de análisis SAM (Tusher et al, 2001): 1) análisis SAM de una clase para la comparación del conjunto de tejidos vegetativos con el conjunto de tejidos reproductivos y 2) análisis SAM de dos clases para la comparación del conjunto de tejidos vegetativos con la raíz, manteniendo un valor de FDR menor al 5% en ambos casos. Adicionalmente se aplicó un límite de expresión de al menos 1.6 veces de modo que el análisis fue más estricto (ver apartado 6.7 de Materiales y Métodos). En estas condiciones se identificaron un total de 185 unigenes de cítricos (3% de los unigenes de CIT1) expresados diferencialmente en tejidos vegetativos (Tabla Suplementaria XXV). El análisis de enriquecimiento funcional, realizado con el programa FatiGO (Al-Shahrour et al, 2004), mostró una sobre- representación significativa de los genes implicados en la GO no redundante de ‘transporte fotosintético de electrones en el fotosistema I’ (GO:0009773, p = 1·10-2) (Fig. 38). Los genes relacionados con la cadena de transporte electrónico, como los que codifican las diferentes subunidades de los fotosistemas I y II, ferredoxina o plastocianina, junto a los que codifican diferentes proteínas de unión a clorofila

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mostraron, como cabía esperar, una expresión diferencial en los tejidos vegetativos (Tabla Suplementaria XXV).

Fig. 38. Ontologías génicas de la componente ‘proceso biológico’ sobre-representadas

en el conjunto de unigenes expresados diferencialmente en los tejidos vegetativos. La escala de color muestra el nivel de significatividad, considerando ontologías enriquecidas aquéllas cuyo valor p corregido es inferior a 0.05.

En el conjunto de unigenes expresados diferencialmente en tejidos vegetativos se identificaron 4 unigenes que codifican TFs y reguladores de la transcripción (2% de los TFs representados en CIT1) (Tabla Suplementaria XXIII). La secuencia del unigen aCL2656Contig1 fue similar al gen CCA1. En Arabidopsis, la mayor expresión de este gen se encuentra en hojas (Wang et al, 1997). El unigen aCL6460Contig1 mostró una secuencia similar al gen ICU4, que está implicado en la morfogénesis de las hojas en Arabidopsis (Serrano-Cartagena et al, 2000). El unigen aCL198Contig1 corresponde con el gen XERICO, un regulador del metabolismo de ABA cuya expresión es mayor en el meristemo apical del brote (Ko et al, 2006). En cuanto a los genes expresados diferencialmente en entrenudos o en hojas (ver apartado 1.2), cabe señalar que ninguno de ellos, excepto el unigen aCL11Contig1, que codifica una proteína relacionada con lectina, mostró una expresión diferencial en tejidos vegetativos.

Regulación del transcriptoma de cítricos por giberelinas

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1. CAMBIOS EN LA EXPRESIÓN GÉNICA DE ENTRENUDOS DE PLANTAS TRANSGÉNICAS DE CÍTRICOS QUE SOBRE-EXPRESAN UNA GA 20-oxidasa

1.1. La sobre-expresión en sentido y en antisentido del gen CcGA20ox1 modifica