COLORACIONES DIFERENCIALES

7.1 -COLORACIÓN DE GRAM

Por medio de esta coloración las bacterias se dividen en dos grandes grupos: Gram negativas y Gram positivas. Esto se debe a que la tinción de Gram pone en evidencia diferencias en la composición química de la pared celular de las bacterias.

-Diferencias en la pared de bacterias Gram positivas (a) y Gram negativas (b)

En las bacterias Gram positivas, el peptidoglicano representa hasta el 90% de la pared, aunque pequeñas cantidades de ácido teicoico suelen formar parte de la misma. Los ácidos teicoicos son polímeros de fosfato de ribitol o fosfato de glicerol. A veces están unidos a los lípidos de membrana de las bacterias Gram positivas y se denominan ácidos lipoteicoicos.

En las bacterias Gram negativas, el peptidoglicano constituye sólo el 10% de la pared. El resto de la pared, de adentro hacia afuera, incluye:

- periplasma

- una capa de lipoproteína que funciona como una especie de anclaje entre las membranas

externas y el peptidoglicano,

- una capa de lipopolisacárido (LPS), molécula que consta de 3 regiones:

-lípido A, con efecto de endotoxina

- núcleo del polisacárido, compuesto por cetodesoxioctonato (KDO), heptosas, glucosa, galactosa y N-acetilglucosamina.

- el polisacárido O: formado por unidades repetitivas de 4-5 azúcares que constituyen el antígeno O, que permite la identificación serológica de la bacteria.

El LPS es muy importante desde el punto de vista clínico! Cuando las bacterias Gram negativas ingresan excepcionalmente en la circulación sanguínea (por ej. en un cuadro de peritonitis), se hace evidente el efecto de la endotoxina del LPS por el desarrollo de fiebre, coagulación vascular diseminada, muerte.

La pared de todas las bacterias (Gram positivas y Gram negativas) posee una capa rígida llamada peptidoglicano o mureína. Éste es un polisacárido formado por dos aminoazúcares:

- N-acetilglucosamina (NAG)

- N-acetilmurámico (NAM)

que se unen alternadamente por enlaces β1-4: NAG-NAM-NAG-NAM-NAG….,

y un pequeño grupo de aminoácidos: L-alanina, D-alanina, D-glutámico y, lisina o ácido diaminopimélico (DAP). Esta estructura se repite a lo largo de toda la pared. La estructura básica del peptidoglicano está constituida por largas cadenas adyacentes del polisacárido y estas cadenas se conectan entre sí a través de puentes peptídicos formados por los aminoácidos mencionados.

-Diferencias entre el peptidoglicano de las bacterias Gram negativas y la de Gram positivas

En las bacterias Gram negativas, como Escherichia coli, las cadenas de NAG-NAM-NAG-NAM- NAG-… se estabilizan a través de puentes peptídicos directos entre el grupo amino del ácido diaminopimélico de una cadena y el grupo carboxilo de la D-alanina terminal de otra cadena adyacente.

En las bacterias Gram positivas, el entrecruzamiento entre cadenas NAG-NAM-NAG-NAM-NAG- … se establece mediante un puente interpeptídico cuya composición varía en cuanto a número y tipo de aminoácidos, de un microorganismo a otro. En Staphylococcus aureus, que es la bacteria Gram positiva que mejor se conoce, el puente interpeptídico está formado por cinco glicinas.

-Pasos a seguir en la coloración de Gram:

Se agrega cristal violeta (primer colorante), luego el mordiente lugol (I2/I-), se decolora con alcohol o alcohol-acetona, y finalmente se aplica fucsina fenicada diluida 1:10 (segundo colorante). Se verán:

- las bacterias Gram positivas: azul violáceas - las bacterias Gram negativas: rojas

Por qué esa diferencia?. La diferencia radica en la composición química y en la estructura física de la pared celular de las bacterias.

Las bacterias Gram positivas no tienen lípidos en su pared, las Gram negativas sí lo tienen y en abundancia. Con cristal violeta (CV) se tiñen todas. Al agregar el mordiente, éste forma un complejo con CV que mejora la tinción:

CV + lugol --- CV – lugol

Luego, al agregar el decolorante alcohol…. qué sucede?

En las bacterias Gram negativas disuelve los lípidos de la pared, penetra en el protoplasma y quita el complejo cristal violeta – iodo.

En las bacterias Gram positivas, que no tienen lípidos en su pared, el decolorante produce deshidratación del peptidoglicano compactándolo, no ingresa al protoplasma y no puede remover el complejo CV – iodo. Estas bacterias permanecen azules.

Por último se agrega fucsina que teñirá solamente las bacterias que fueron decoloradas por el alcohol. Estas células se verán rojas.

Nota: las levaduras teñidas al Gram se ven positivas, aunque presentan una pared celular con una estructura química distinta a la pared de las bacterias Gram positivas.

7.2 -COLORACIÓN DE ZIEHL – NEELSEN para bacterias ácido-alcohol resistentes

Esta tinción se utiliza para identificar a todas las bacterias del género Mycobacterium, que comprende dos patógenos importantes para el hombre: M. tuberculosis, agente causal de la tuberculosis y M.

leprae, agente de la lepra. También se utiliza para identificar cepas del género Nocardia. Estos

microorganismos se consideran Gram positivos pero por la técnica de Gram se colorean difícil e irregularmente, de ahí que se emplee la coloración de Ziehl – Neelsen.

Son bacterias ácido-alcohol resistentes (BAAR). La pared de las BAAR está compuesta por:

- peptidoglicano, muy similar al de las bacterias Gram positivas y Gram negativas, pero donde el aminoazúcar N-A-M ha sido sustituido por N-glicosilmurámico (N-G-M); y cada cadena permanece unida a la otra mediante un tetrapéptido.

- un polímero de ácido micólico – galactosa – arabinosa, (el ácido micólico, que es un hidroxilípido de cadena larga y ramificada)

- lípidos superficiales (micósidos, y cord factor: glicolípidos y sulfolípidos). El resto de la estructura es similar a la pared de las bacterias Gram positivas ya que así se viene considerando a este grupo, pero no se han descripto ácidos teicóicos.

Pasos a seguir en la coloración de Ziehl – Neelsen

Esta técnica se basa en la propiedad que tienen algunas bacterias de resistir la decoloración con alcohol-ácido después de teñirlas con fucsina fenicada concentrada y en caliente. Se usa una mezcla de fucsina básica y fenol (fucsina fenicada) aplicando calentamiento progresivo para conseguir que el colorante penetre dentro de la célula. La reactividad radica en el grupo carboxilo del ácido micólico que reacciona con el ion amonio de la fucsina.

El fenol facilita la penetración de la fucsina en la capa lipídica.

Se decolora con alcohol-ácido y se agrega el contracolorante azul de metileno. En el preparado se verán:

- BAAR: bacilos de color rojo

Se considera que la ácido-resistencia de las BAAR se debe al alto contenido de lípidos de la pared de estas bacterias, fundamentalmente el ácido micólico. El ácido micólico forma un complejo con el peptidoglicano de la pared de estas bacterias y dicho complejo impide de alguna manera el contacto con el decolorante alcohol – ácido en la etapa de decoloración.

El complejo fucsina – fenol resiste la decoloración porque está muy ligado a los lípidos ya que es más soluble en ellos que en el decolorante. Existen diferentes opiniones que señalan otras posibles causas, como la formación de un complejo estable de fucsina – RNA bacteriano que se mantendría unido cuando se realiza una vigorosa decoloración.