COLORACIONES ESPECIALES

Las tinciones especiales se utilizan para colorear partes específicas de microorganismos, como endosporas, flagelos y para detectar la presencia de cápsulas.

8.1 - CÁPSULA

La cápsula es un elemento no esencial para la fisiología bacteriana, y está presente en algunas bacterias Gram negativas y Gram positivas. Generalmente está formada por polisacáridos y raramente por proteínas.

Algunas veces se utilizan los términos cápsula o capa mucosa para describir esta capa de polisacárido, aunque también se emplea el término glicocáliz.

El glicocáliz contiene habitualmente glicoproteinas y un gran número de polisacáridos (polialcoholes y aminoazúcares). El glicocáliz puede ser grueso o delgado, rígido o flexible, dependiendo de la naturaleza química en cada organismo. Cuando las capas rígidas están organizadas en una matriz impermeable que excluye colorantes como la tinta china; a esta estructura se la denomina cápsula. Cuando el glicocáliz se deforma con facilidad, no excluye partículas y es más difícil de visualizar, se denomina capa mucosa.

-Funciones de la cápsula:

- Protege a la mayoría de las bacterias de la fagocitosis, favoreciendo la invasión y multiplicación en el organismo infectado.

- Tiene poder antigénico, allí reside el antígeno K. - Su presencia es signo de virulencia.

Las cápsulas desarrollan en los productos patológicos o en los medios de cultivo enriquecidos con proteínas animales, por ej. leche. La cápsula puede rodear a una célula bacteriana, a dos, y a varias cadenas.

-Tinción de BURRI (para cápsula)

Es una tinción negativa que permite poner en evidencia la cápsula sin colorearla. El fondo y las restantes estructuras se colorean.

Pasos a seguir

En el Trabajo Práctico se realiza en un portaobjetos una suspensión de gérmenes capsulados en una gota de tinta china, se hace el extendido, se seca, se fija a la llama, se cubre con cristal violeta, se lava y se observa.

La cápsula se verá como un halo claro refringente alrededor del cuerpo bacteriano teñido de violeta, sobre un fondo oscuro.

8.2. - ESPORAS

Las esporas son estructuras presentes en algunas especies bacterianas, principalmente de los géneros

Clostridium y Bacillus. Pueden estar en el interior de una bacteria (endosporas) o permanecer libres.

Son órganos refringentes, esféricos u ovales que constituyen la forma de resistencia bacteriana ante situaciones de deficiencia nutricional, desecación, radiación, calor, ácidos, y desinfectantes químicos. Características:

- son muy impermeables a los colorantes, por lo que a veces se ven como regiones sin teñir dentro de las células que han sido teñidas con Gram. Para teñir las esporas se utilizan métodos especiales.

- son muy termorresistentes, esto está en relación con el escaso contenido de agua y la gran cantidad de dipicolinato de calcio que se encuentra en el núcleo de la espora.

- el núcleo se encuentra parcialmente deshidratado y de allí la consistencia gelatinosa del citoplasma del núcleo.

- Contienen SASPs (pequeñas proteínas ácido solubles) que estabilizan y protegen el ADN.

Algunas esporas no deforman el cuerpo bacteriano (Bacillus) y otras son deformantes (Clostridium). Pueden tener ubicación: central, subterminal o terminal.

Estructura de la espora:

La capa más externa es el exosporio, una fina y delicada cubierta de naturaleza proteica. Por debajo de esta se encuentran las cubiertas de la espora (externa e interna), que se componen de varias capas de proteínas específicas de la espora. Por debajo de las cubiertas de la espora se localiza el cortex, que es una capa de peptidoglicano con uniones laxas. Internamente, y por debajo del cortex, se presenta el núcleo o protoplasto de la espora, que contiene la pared celular normal (similar a la de la célula vegetativa), la membrana citoplasmática, el citoplasma, el nucleoide, etc.

l proceso de formación de endosporas en el interior de una célula vegetativa (progenitora) se denomina esporulación o esporogénesis.

Las endosporas pueden permanecer en estado de latencia durante miles de años. Una endospora recupera el estado vegetativo mediante un proceso llamado germinación.

a) Coloración de MOELLLER para esporas

En esta técnica, la fijación se realiza por métodos químicos.

El ácido crómico actúa como mordiente y sensibilizante de las cubiertas de la espora. La fucsina fenicada de Ziehl penetra más fácilmente a la espora por calentamiento. La decoloración se realiza con ácido sulfúrico al 5 % y alcohol, pero por ser la pared de la espora impermeable, la espora no se decolore y sí lo hace el resto de la bacteria.

Finalmente, se agrega el contracolorante: azul de metileno, de modo que: - la espora se observará de color rojo

- el cuerpo vegetativo se observará azul

Nota: por la técnica de Gram, las esporas se ven como áreas incoloras dentro de las células teñidas.

b) Coloración de WIRTZ – CONKLIN para esporas

1. Tinción con verde de malaquita.

2. Calentamiento con emisión de vapores durante 6 a 10 minutos, para que el colorante penetre a través de las paredes de la endospora.

3. Lavado con agua, que elimina el colorante verde de todas las partes de la célula, con excepción de las esporas.

4. Tinción de contraste con el colorante fucsina de Ziehl o safranina.

Al final del proceso:

- las esporas bacterianas: de color verde - células: de color rojo.

Las bacterias Bacillus anthracis y Clostridium perfringens, agentes etiológicos del carbunco y la gangrena, respectivamente, forman esporas y pueden ser identificadas mediante esta tinción.

8.3 -FLAGELOS

Los flagelos son elementos facultativos, órganos de locomoción, responsables de la movilidad bacteriana. Se presentan en algunos procariotas y son responsables de su propulsión en medios líquidos. Son apéndices largos y finos que se encuentran libres por un extremo y unidos a la célula por el otro.

Según la disposición de los flagelos sobre la superficie bacteriana, las bacterias se pueden clasificar en:

- anfitrica: tienen un penacho de flagelos en cada polo.

- lofotrica (lofos: penacho, tricos: pelo): tienen un penacho de flagelos en un solo polo. - monotrica: presentan un solo flagelo polar.

- peritrica (peri: alrededor): alrededor de toda la superficie bacteriana. Las bacterias desprovistas de flagelos se conocen como atricas.

Los flagelos se componen de tres partes: - filamento

- gancho - cuerpo basal.

El filamento del flagelo bacteriano está compuesto de subunidades de una proteína llamada flagelina y tienen especificidad antigénica, allí reside el antígeno H.

En las bacterias Gram negativas, existe un anillo externo que está anclado en la capa de lipopolisacárido (anillo L), otro en la capa de peptidoglicano de la pared celular (anillo P) y un anillo interno (S-M) situado en la membrana citoplasmática.

En las bacterias Gram positivas, como carecen de la capa externa de lipopolisacárido, solo existe el par de anillos interno y el anillo P.

a) IMPREGNACIÓN ARGÉNTICA para flagelos

El método que veremos en el TP es una impregnación argéntica, ya que los flagelos al ser tan finos (20 nm de diámetro), no pueden observarse mediante coloraciones comunes, sino que hay que recurrir a tinciones específicas que aumentan su diámetro. Se deben examinar cultivos jóvenes ya que los cultivos con más de 24 h presentan células sin flagelos.

Utiliza ácido tánico actúa como mordiente, luego el complejo formado por AgNO3 y NH4OH se deposita como Ag2O sobre la estructura flagelar.

Ag+ _{+ OH}- _{--- AgOH --- > Ag} 2O

Todos los lavados se deben realizar con agua destilada, dado que el agua común tiene cloruros que reaccionarían con Ag+ _{formando un precipitado de AgCl lo cual impedirá la observación.}

b) IMPREGNACIÓN ARGÉNTICA DE FONTANA TRIBONDEAU para espiroquetas y espirilos.

Esta técnica es útil para espiroquetas, entre las cuales está Treponema pallidum, el agente de la sífilis. Estos microorganismos son extremadamente finos por lo que no se colorean por los métodos habituales.

Lo primero que se hace es una deshemoglobinización con líquido de Rouge. Esto se hace porque generalmente la muestra se toma directamente de la lesión o chancro y viene acompañada de sangre que dificulta la observación. El fundamento de esta técnica es similar al de la técnica para flagelos.

NOTA: Al leer cada técnica por la Guía de TP., remitirse a la teoría de Estructura bacteriana.

BIBLIOGRAFÍA

-Madigan, M.T; Martinko, J.M; Dunlap, P.V; Clark, D. P. 2009. Brock. Biología de los Microorganismos. 12ª ed. Ed Prentice Hall, USA.

- Pumarola. Microbiología y Parasitología Médica. 2ª. ed. Ed.Salvat. 1995 - http://www.telmeds.org/atlas/bacteriologia/