Comparación de la conformación del esqueleto principal La comparación estructural

de dos modelos cristalográficos que representan diferentes estados funcionales y/o físicos de la misma proteína puede parecer fácil si grandes diferencias conformacionales son detectadas por inspección visual simple. Dado que los modelos cristalográficos contienen errores en las coordenadas atómicas, la precisión de las mismas debe ser inmediatamente considerada si cambios estructurales sutiles están en juego o si el objetivo es evaluar pequeños cambios internos de un cuerpo rígido que ocurren en combinación con cambios a gran escala en la estructura terciaria o cuaternaria de la proteína.349-

352 _{Estos problemas son típicos de la investigación de}

fenómenos alostéricos, como los que nosotros estudiamos. El estudio de la incertidumbre sobre la posición atómica cobra también importancia obvia cuando se decide emprender estudios de diseño de fármacos basados en la estructura.353-356 Recurrimos al programa ESCET328-330 (ver sección de métodos al

Figura 4.2.7.1.1. Superposición estructural de los modelos de HSA-SH a temperatura criogénica y ambiente según ESCET. El

programa ESCET calcula distancias entre pares de átomos A y B y A’ y B’ equivalentes en los modelos, estima de acuerdo con Cruickshank la incertidumbre posicional de las respectivas coordenadas, para establecer si las diferencias en las distancias A-B y A’-B’ son estadísticamente significativas. Las regiones de

la proteína coloreadas de azul fueron

catalogadas como zonas sin cambios confromacionales significativos. Las zonas

rojas, son zonas evaluadas como flexibles, y la

zona en verde, fue detectada como un cuerpo rígido secundario. Para estas comparaciones se aceptaron cambios como significativos usando un nivel de confianza de 95 % ( = 0.05).

respecto) como una aplicación de la teoría de predicción de la incertidumbre posicional de Cruickshank.331

La comparación de coordenadas atómicas con ESCET muestra que los modelos 1AO6 y 1BM0 no difieren significativamente de nuestro modelo si se establece un intervalo de confianza para la diferencia de las medias de 2.25 desviaciones estándar o superior (Fig. 4.2.7.1.1). Sin embargo, si se disminuye la exigencia y la sensibilidad es mayor se puede observar que la excitación térmica (nótese que estamos atribuyendo las diferencias entre modelos criogénico y a T ambiente, a la temperatura solo) parece determinar pequeños cambios (zonas flexibles, en rojo, cuerpos rígidos, en verde y celeste) en el dominio I subdominio A con alta preferencia con respecto al DII y III y que los cambios en DII son más pequeños pero también limitados a subdominio IIA (Fig. 4.2.7.1.2, Paneles A, B y C). De acuerdo con esta comparación de nuestro modelo criogénico (XXXX) y los de temperatura ambiente (1AO6 y 1BM0), los tres dominios homólogos de la HSA presentan diferencias en el patrón y número de puentes disulfuro que favorecen la movilidad del dominio I (5 puentes disulfuro vs. 6 de los dominios II y III). La forma de la curva de ajuste indica que estos fenómenos son de carácter cooperativo. Estos resultados se pueden entender teniendo en cuenta la estructura del subdominio de IA en comparación con el subdominio IIA (Fig. 4.2.7.1.2, Paneles B y C, respectivamente). Esta parte del dominio IA es menos ordenado, más flexible, en comparación con las regiones similares en los dominios II y III lo que resulta en cambios térmicos inducidos en la conformación de mayor magnitud que los cambios en los dominios II y III. El hecho de que se produzcan cambios similares pero de menor magnitud se producn en el dominio II podría ser tambien consecuencia de la estabilización del dominio II por la interacción de superficies con los dominios I y III, que están en parte involucrados en el montaje del sitio de unión de Sudlow I.

Figura 4.2.7.1.2. Pequeños cambios conformacionales en los dominios IA y IIA asociadas a la excitación térmica en cristales apoHSA. Comparación de los modelos de temperatura criogénica (XXXX) y ambiente

(1AO6) usando ESCET. Panel A y su Inserto. La sensibilidad del análisis con ESCET fue variada ajustando el parámetro “lolim” entre 2.25 y 1 sigma. Si se realizan evaluaciones con  ≤ 0.05, muy pocos residuos son considerados como parte de un cuerpo rígido secundario, con un intervalo de confianza de 1.8 d aproximadamente 25 residuos del subdominio IA están en esta condición (Inserto, sector de color verde), pero ningun residuo de los dominios II escapa al cuerpo rígido principal (Inserto, sector azul mayoritario). Las líneas representan las curvas de mejor ajuste a una ecuación de Boltzmann. Paneles B y C. Los dominios I (Panel B) y II (Panel C) de acuerdo con el modelo 1AO6 fueron superpuestos utilizando el programa PyMOL y se presentan por separado. Se puede apreciar la similitud estructural de los dominios I y II, pero también se puede notar que la mayor diferencia estructural reside justamente en el sector térmicamente más lábil del dominio IA (señalado con óvalos). Este sector presenta un patrón de puentes disulfuro distinto. El Dominio IA carece de un puente disulfuro en esta región, el que está presente en los otros dos dominios (II y III).

1 .0 0 1 .2 5 1 .5 0 1 .7 5 2 .0 0 2 .2 5 0 2 0 4 0 6 0 8 0 b D o m I R T vs C T D o m II R T vs C T N° d e residuo s en cuerpo rigido secundario

A m plitu d d e l in te rva lo d e c on fia n z a (d)

a

A B

Los modelos disponibles al momento de esta tesis de complejos de la HSA-SH con ligandos ocupando el sitio de Sudlow I son de baja resolución (2BXB, 2BXC y 2BXD, 3.2, 3.1 y 3.05 Å). Dejando esto de lado por un momento, la comparación estructural de los modelos a temperatura ambiente de la apoproteína y estos complejos brinda resultados globales similares en magnitud pero sustancialmente distintos en calidad: Se detectan cambios muy sutiles en la conformación de los dominios I y II, fundamentalmente localizados en zonas desordenadas del domino I y en el sitio de unión de Sudlow I, particularmente a nivel de la Tyr150 y la Ala151, mientras que se verifica la separación del dominio III como cuerpo rígido del resto de la molécula (Fig. 4.2.7.1.3).

Figura 4.2.7.1.3. Comparación de la conformación del esqueleto principal (carbonos alfa) de modelos de apoHSA y HSA en el complejo con ligandos del sitio de Sudlow I a temperatura ambiente. La

comparación de los modelos de RT de apo-HSA (1AO6 y 1BM0) y los complejos de la HSA (2BXB, 2BXC y 2BXD) se llevó a cabo como en la Fig. 4.2.7.1.2. Panel A. El número de residuos en cada dominio que parecen cambiar de conformación después de la unión del ligando de acuerdo a ESCET se representa en función de la amplitud del hemi intervalo de confianza expresada en sigmas de la diferencia de distancias. La mayoría del DIII sufre una rotación y separación en relación al resto de la molécula. Sin embargo, los cambios en los DI y DII son muy sutiles y afectan a un número limitado de residuos, incluyendo principalmente los directamente involucrados en la unión del ligando. Panel B. La figura

1.0 1.5 2.0 0 50 100 150 200 Domain I Domain II Domain III 1.0 1.5 2.0 2.5 1 10 100 # D o m a in I re s id u e s cut-off (Å) cut-off (Å) # residues out of P R B A B