Nuevo método de comparación de factores B

Para poder comprender el fenómeno alostérico en estudio, comparando nuestro modelo con otros de interés, recurrimos también a la comparación de factores B. Considerando que se acepta que la comparación directa de factores B entre distintos modelos es al menos engañosa, luego de observar que los factores B de nuestro modelo a temperatura criogénica fueron inesperadamente mayores que los factores B de modelos de la HSA-SH de cristales a temperatura ambiente (Fig. 4.2.6.3.1, Panel A), y dado el fracaso de otros métodos de comparación de factores B (Fig. 4.2.6.3.1, Panel B), emprendimos la tarea incierta de desarrollar un nuevo método de comparación de factores B. El nuevo método propuesto se basa en los trabajos previos de Cruickshank331 y Read.357 El método se inspira en tres observaciones principales interrelacionadas:

1) Hemos podido observar (Fig. 4.2.6.3.1, Paneles A-C) que la comparación de las incertidumbres posicionales ( ir, )331 permite reconciliar los resultados cristalográficos con la física de los cristales de proteínas.333,340,350,358-359 Schneider reconoció el potencial de DPI

i r ), (

 como estimador no sesgado de la incertidumbre posicional de átomos,330 la cual sería función de los factores B atómicos (ec. 4.1.8.1 y 4.1.8.3). Nosotros entendimos que en las ecuaciones de Cruickshank está la clave (la información necesaria) para poder poner en una escala común los factores B de dos (o más) modelos distintos, algo que ni Cruickshank ni Schneider parecen haber advertido.

2) Como veremos en mayor detalle y generalidad en breve, los resultados presentados en las Figs. 4.2.6.3.4 a 4.2.6.4.3 nos llevaron a pensar que una fuente frecuente de error en los modelos cristalográficos incompleta o erróneamente refinados es la subestimación de los factores B, lo que se acompaña naturalmente de valores altos de R . Téngase en cuenta que el R

traduce inexactitudes (sesgo) en las fases del modelo.360-361 _{Dicho de otra forma, estamos}

proponiendo que en etapas relativamente avanzadas del refinamiento de un modelo cristalográfico cualquiera se debe esperar un aumento de los Batómicos y del Bavg del modelo.

Como corolario, un modelo A refinado de forma que acuerde mejor con los datos podrá tener Bavg más altos que otro modelo A’ con mayor RFREE (o RW) sin que ello implique menor precisión

de A, si no que por el contrario, se estará frente a un modelo A más exacto, con coordenadas y factores B mejor determinados que A’.

3) El reconocimiento cabal del concepto ampliamente aceptado de que los valores de los factores Bj pueden verse aumentados por errores del modelo en las posiciones atómicas362, ejemplifica la forma intrincada con que se relacionan los errores en las coordenadas (producto por ejemplo de un refinamiento o modelo incompleto) y el desorden real del cristal, una relación que como veremos ha sido mejor descrita por Read.357 Dicho de otra forma, a todo efecto práctico, la incertidumbre posicional que deriva de la ecuación 4.1.8.1 no desglosa (como no lo hacen los propios factores B) los distintos componentes de la falta de información posicional que se está estimando, ergo, el punto 1 se confirma: si es cierto que los DPI

i r ), (

 son comparables entre modelos como lo afirman varios autores,324,331,363-364 es cierto que la información necesaria para poner en una escala común los factores B de dos modelos ha de estar contenida en la ecuación 4.1.8.1.

A continuación abordaremos en más detalle las tres observaciones interdependientes que mencionados arriba, aunque no en el mismo orden en que se presentaron.

4.2.8.1. Correlación negativa de Bavg con RFREE y subestimación de Bi por refinamiento

incompleto o inestable.

El objetivo del refinamiento es minimizar los errores del modelo, disminuir su incertidumbre, sabiendo que cierto nivel de error será al final irremovible.365 Cuando detener el refinamiento es una de las preguntas que el cristalógrafo debe resolver caso a caso. Consideramos la aproximación lineal (ec. 4.1.8.3) propuesta por Peters-Libeu y cols.364 y por Schneider330 a la teoría de predicción de errores estándar posicionales desarrollada por Cruickshank desde los años 50.331

min free 3 / 1 2 / 1 obs 2 / 1 , 3 ( / ) C R d B B n N avg i i DPI i r _          (4.1.8.3)

Esta ecuación establece que existe una relación directa entre la incertidumbre posicional del átomo i y el valor de Bi. A los efectos de la teoría propuesta por Cruickshank (en particular, de la

expresión 4.1.8.3), el cociente N_i /n_obs (N° de parámetros10/N° de observaciones11) puede disminuir y con ello la incertidumbre, solo si se usan más datos (ejemplo: se realiza una nueva colecta de datos, de forma de que ciertas reflexiones no registradas en la colecta previa ahora están contempladas) o si se disminuye el número de parámetros (por ejemplo: se abandona el refinamiento de B atómico y se pasa al refinamiento de B por residuo).12 En forma similar, la

10 _{N° de parámetros = [(3 coordenadas + Factor B)×9377 átomos = 37508]} 11 _{N° de observaciones = 48633}

12 _{Sin embargo, cabe aclarar que otras ecuaciones similares a H11 que usan RW y no RFREE también pueden verse afectadas por el} uso de contenciones. (331) Cruickshank, D. W. Acta crystallographica 1999, 55, 583. Desde el punto de vista estadístico, la inclusión de nuevas contenciones o constricciones debe verse como una disminución efectiva del número de parámetros. Sin embargo, desde el punto de vista del refinamiento, los programas toman las contenciones como observaciones.

completitud C y dmin, típicamente no

dependen del refinamiento. De acuerdo con la ecuación 4.1.8.3, no hay dudas de que durante el refinamiento la incertidumbre del modelo disminuye debido cambios en el RFREE. Sin embargo queremos hacer notar

que además de cambios en el RFREE, el

refinamiento se acompaña de cambios sistemáticos (una disminución) en el inverso de Bavg (1/Bavg, ver Fig. 4.2.6.4.2). Esto es

importante porque sugiere una razón (entre otras) por la que los factores B de nuestro modelo son mayores que los B del modelo de referencia del cristal a temperatura ambiente. De acuerdo con esto, nuestro modelo no solo tendría menor RFREE, menor incertidumbre posicional, sino también mayor Bavg

por el solo efecto de un mejor acuerdo del modelo con las observaciones.

La Fig. 4.2.8.1.1 intenta corroborar como un fenómeno general entre modelos de HSA, la hipótesis de que cambios en RFREE y Bavg se correlacionan en forma negativa. En la Figura

4.2.8.1.1 se puede observar que al igual que lo que observamos durante el refinamiento de nuestro modelo, existe una correlación negativa entre Bavg y RFREE en este set de datos de

0.24 0.26 0.28 0.30 40 60 80 y = a + b*x R2 = 0.22992

Valor Error Estandar a 255.06438 90.05954 b -677.21072 327.17772

1AO6

y = a + b*x R2 0.98

Valor Error Estandar a 344.14 20.35 b -1042.45 74.16 B avg (A 2 ) R FREE XXXX 269 1BM0 2BXD 2BXH 1E7A 2BXF 2BXE 2BX8 2BXB 1E78 2BXG 2BXC

Figura 4.2.8.1.1. Gráfico de Bavg vs RFREE para modelos

de HSA tomados de la PDB. Se usan datos tomados de la

PDB provenientes del refinamiento originalmente reportado por los autores de los modelos. Se usaron los modelos de HSA que no presentan grandes cambios conformacionales con respecto a nuestro modelo (cristales con grupos de espacio P1 y P21, obtenidos a partir de datos colectados a T ambiente, refinados sin grupos TLS). Se excluyeron modelos a temperatura criogénica y modelos de HSA saturada con ácidos grasos. Se incluye para referencia, los datos correspondientes a nuestro modelo. La línea roja se ajusta a los modelos con mínimos

Bavg para todo RFREE. La línea negra gruesa ajusta a todos los puntos (excluyendo nuestro modelo a temperatura criogénica).

modelos de HSA. Si bien existe cierta correlación negativa, esta es más fuerte para un subset de modelos que se caracterizan por poseer los valores mínimos de Bavg para todo RFREE cuando son

comparados con el conjunto de modelos. Nótese que la pendiente en de la línea roja en la Fig. 4.2.8.1.1 (-1042 ± 74 Å2) tiene un valor en el orden al hallado en para el caso del uso de contenciones de SNC en el refinamiento de nuestro modelo (-1811 ± 74 Å2).

En la Fig. 4.2.8.1.2 mostramos los resultados obtenidos al intentar la generalización para modelos cristalográficos de otras proteínas. El análisis de los grupos de modelos de cristales de proteínas tomados de los reportes originales archivados en la PDB (en negro) mostró un comportamiento variable de Bavg como función de RFREE (Fig. 4.2.8.1.2). Es probable que

distintas opciones de refinamiento, como por ejemplo el modelo de solvente empleado, expliquen parte de la variabilidad. Por tanto, decidimos recurrir a modelos depositados en la base de datos PDB_Redo (en rojo). PDB_Redo almacena modelos refinados independientemente en forma semi automática a partir de datos experimentales (mtz) reportados por los autores de los modelos presentes en el clásico PDB usando criterios relativamente uniformes. En general se puede ver que los modelos depositados en PDB_Redo poseen menores Bavg y menores RFREE

que los modelos originales. Sin embargo, el análisis de modelos de PDB-Redo muestra invariablemente una correlación negativa (aunque con distinta fuerza de correlación y pendiente) entre Bavg y RFREE.

0.20 0.21 0.22 0.23 0.24 0.25 10 20 30 40 50 60 70 PDB original