Compatibilidad y tolerabilidad del biomaterial integrado en el tejido cerebral.

Por su elevada flexibilidad y resistencia, la seda comenzó a utilizarse originariamente como material de sutura para todo tipo de intervenciones, sin embargo, la existencia de repuesta inflamatoria en algunos pacientes, suscitó dudas sobre la posible alergenicidad de los dos polímeros que componen la seda: sericina y fibroína (Thurber et al 2015). Los estudios de inmunoreactividad de ambos polímeros por separado, confirmaron que por sí solos no causaban reacciones alérgicas (Wohlrab et al 2012, Yang et al 2015) y que la moderada respuesta inflamatoria observada en los pacientes podía ser adscrita al uso de la seda en su forma nativa (sericina:fibroína). (Thurber et al 2015). La fibroína constituye el 70% de la seda en los capullos de

Bombyx mori (Inoue et al 2000). Su nula immunogenicidad, debido a la carencia de motivos peptídicos en su secuencia aminoacídica (Zhou et al 2001) reconocibles por las células del sistema inmunológico, y la versatilidad de formatos en los que la fibroína puede ser reconstituida (Thurber et al 2015), hace de este biomaterial un candidato idóneo para multiples aplicaciones biomédicas. Ha sido empleada como soporte estructural y/o funcional para el crecimiento de distintas estirpes celulares, incluyendo MSCs (Calabrese & Kaplan 2012, Ferri et al 2016, Floren et al 2016, Luan et al 2006, Sun et al 2016), fibroblastos (Minoura et al 1995a), osteoblastos (Tong et al 2016, Varkey et al 2015), condrocitos (Kambe et al 2010), e incluso poblaciones de linaje neural como, neuronas (Roloff et al 2014, Sun et al 2015b) células de Schwann (Hu et al 2012, Schuh et al 2016) o astrocitos (Qu et al 2013), extendiéndose también su uso como vehículo para la liberación de moléculas y diversos factores terapéuticos (Cao et al 2017, Ebrahimi et al 2017, Li et al 2017, Yang et al 2017) .

El primer objetivo alcanzado en esta memoria fue el desarrollo de un hidrogel-inyectable de gelificación retardada para trasplante intra-cerebral. Ajustando los parámetros de sonicación y la concentración de la fibroína, se consiguió que la aplicación de dos pulsos consecutivos de ultrasonidos sobre el polímero en solución, condujera a su gelificación in vitro en un tiempo aproximado de 10-15 min, lo que favoreció el trasplante del biomaterial en estado pre-gel (estado fluido), y su posterior gelificación in situ, minimizando el daño tisular, requisito deseable en un biomaterial de aplicación intra-cerebral (Nih et al 2016). El tiempo de gelificación del biomaterial una vez trasplantado in vivo no fue analizado, sin embargo la localización de los depósitos del biomaterial a distintos tiempos post-trasplante cerca de la zona del implante (ver sección resultados 4.1.2. figura 4.2.), sugiere que la formación del hidrogel en el interior del parénquima cerebral, tuvo lugar en una ventana temporal cercana a la observada in vitro. Esto es así puesto que un mayor tiempo de gelificación podría haberse relacionado con un mayor grado de dispersión

150

del biomaterial por el tejido, identificándose múltiples depósitos de fibroína en regiones alejadas al implante. Consideramos que la localización del implante en la región de interés, el cuerpo estriado, resultó adecuada para conseguir el efecto terapéutico buscado. En nuestro modelo de daño, el estriado se localiza peri-lesionalmente, y cercano al SVZ (nicho neurogénico en el cerebro adulto), siendo nuestra hipótesis de trabajo, que una mayor supervivencia de las MSCs al ser integradas en los hidrogeles, favorecería una secreción continuada de factores neurotróficos, consiguiendo así estimular la neurogénesis endógena del tejido, lo que podría favorecer mecanismos de plasticidad y/o la integración de nuevas neuronas en los circuitos dañados la recuperación funcional de los animales. Otra corriente ideológica sostiene que una mejor localización para el trasplante terapéutico es en la región lesionada, donde tras la muerte celular se origina una cavidad, lo que permite aceptar un mayor volumen del biomaterial y/o infusión celular, sin inducir daño tisular adicional (Clarkson et al 2010, Moshayedi et al 2016, Overman et al 2012, Zhong et al 2010). Sin embargo, el implante en el interior de la cavidad isquémica, podría impedir la restitución de la representación original dañada o incluso la remodelación de áreas peri-lesionadas. Además, dado que en la cavidad infartada se presenta un ambiente altamente hostil, podría hacer fracasar la viabilidad de las células trasplantadas (Savitz et al 2004) a diferencia de cuando son trasplantadas en regiones adyacentes (Kelly et al 2004), donde la supervivencia del injerto es altamente superior. Por otro lado, el trasplante intra-estriatal de células madre no sólo ha sido empleado en estudios pre-clínicos de ictus (Darsalia et al 2007, Mora-Lee et al 2012), sino también en modelos experimentales de la enfermedad de Parkinson (Bjorklund et al 2002, Effenberg et al 2015, Nakaji-Hirabayashi et al 2013), Huntington (Reddington et al 2014) o Alzheimer (Nagahara et al 2009), y dado que el objetivo de la caracterización de los hidrogeles de fibroína no sólo estriba en su uso en terapia neurorrestaurativa en el ictus, el análisis de su biocompatibilidad tras su implante en el estriado (caudado-putamen), permite estudiar las posibles interacciones de este material con la intrincada red neuronal/axonal presente en esta compleja estructura cerebral (Yang et al 2009a), obteniendo así una visión completa sobre el grado de inflamación/toxicidad potencial, y su posible aplicación en otros modelos de enfermedades neurodegenerativas, así como el estudio de los posibles déficits en la coordinación sensorimotora de los animales, como se relatará a continuación.

En cuanto a las propiedades mecánicas del hidrogel obtenido (módulo elástico), fueron similares a las descritas para el cerebro de roedores (ver sección resultados 4.1.1. tabla 4.2.). La mecanosensibilidad celular se reconoce como un actor importante en la fisiología y la patología celular/tisular, acompañando y/o contribuyendo en procesos patológicos (Georges et al 2007, Zhao et al 2010). La mayoría de las células, incluidas las células gliales y las neuronas, son mecanosensibles y responden a estímulos mecánicos de su entorno (Moshayedi et al 2014, Zhang et al 2015b), pudiendo participar éstos, en la diferenciación de células madre (Engler et al 2007), guiando la migración axonal (Gilmour et al 2004), o en la activación de la respuesta inmune (Lam et al 2014, Moshayedi et al 2014). Moshayedi y col., analizaron el grado de respuesta inflamatoria

151

derivada del implante intra-cortical en estado previo de gel de ácido poliacrílico (PAA), al cabo de 1 y 3 semanas. Observaron como aquellos hidrogeles que presentaban valores alejados al módulo elástico del tejido cerebral, promovían un incremento en la activación de la microglía (CD11b) y en la presencia astrocitaria (GFAP) (Moshayedi et al 2014). Lam y col., describieron un fenómeno similar, pero en esta ocasión trasplantaron intra-estriatalmente soluciones de ácido hialurónico (HA) para su gelificación in situ (Lam et al 2014). Dos semanas después del implante, identificaron una mayor presencia de células astrocitarias (GFAP+) en aquellos animales trasplantados con hidrogeles de mayor módulo elástico, sin embargo en esta ocasión no detectaron un incremento en la microgía (Iba1+) en función del grado de rigidez del biomaterial. Es por ello que la obtención de un hidrogel con propiedades elásticas comparables a las del tejido cerebral, fue requisito esencial para el desarrollo del presente trabajo de tesis. En nuestro caso no estudiamos los efectos de la rigidez del hidrogel de fibroína trasplantado en el estriado de los ratones, sin embargo la inflamación detectada al cabo de 2 semanas post-implante del hidrogel seleccionado como adecuado para el trasplante (2% p/v), fue similar a la observada en el grupo de animales inyectados con PBS, sugiriendo que ni el grado de rigidez, ni la presencia de la fibroína en sí, indujo respuestas inflamatorias crónicas ni de relevancia más allá de las primeras 72 horas. La reducida bio-respuesta tisular asociada al implante de fibroína, ha sido descrita con anterioridad empleando distintos formatos de este biomaterial en diversos tejidos distintos al cerebral. Por ejemplo, el implante intramuscular de films de fibroína sobre los que se cultivaron previamente MSC, produjo una menor infiltración de macrófagos hacia los depósitos del material en relación al implante de films de colágeno o ácido poli-láctico (PLA), (Meinel et al 2005). De forma similar, en piel (Guan et al 2010) y en huesos largos (tibia y húmero) (Uebersax et al 2013), se observó una menor reacción inflamatoria hacia la fibroína que hacia los films de alcohol poli-vinilico (PVA) (Uebersax et al 2013). Empleada como fibra en la reparación de nervio ciático en ratas, el reclutamiento de macrófagos en la vecindad del injerto de fibroína, fue similar a la infiltración presente tras el injerto de nervio autólogo (Guan et al 2010), así como cuando ha sido empleada en la reparación de heridas en la mucosa bucal en ratas, tanto en formato de film como de andamio poroso, se ha observado una reducida respuesta inflamatoria (células CD45+) (Ge et al 2012).

Centrándonos en el tejido cerebral, Kim DH y col., diseñaron un formato de fibroína soluble para mejorar la conductividad de una matriz de electrodos y realizar el registro crónico de la actividad evocada visual en la corteza cerebral de gatos (Kim et al 2010a). Cuatro semanas después del implante de los electrodos, y tras la solubilización de la fibroína para mejorar el contacto de los electrodos con el tejido cerebral, examinaron cortes coronales del cerebro de los animales trasplantados con tinción hematoxilina/eosina (HE), y no observaron una agregación celular de consideración, lo que identificaron como ausencia de respuesta inmune. Un año más tarde Kim DW y col., emplearon “films“ de fibroína en ratas craneotomizadas como soporte para la reconstrucción de una duramadre artificial. Tras el implante, los niveles de moléculas pro-

152

inflamatorias como IL-6, IL-1β o TNF-α, ciclo-oxigenasa-2 (COX-2) fueron significativamente inferiores a los detectados tras el injerto de una duramadre artificial basada en colágeno (Kim et al 2011, Wang et al 2008a) Por otro lado, Chan y col., en un modelo animal de la enfermedad de Alzheimer determinaron la existencia de gliosis reactiva (detección de astrocitos; células GFAP positivas) en respuesta al implante intra-ventricular de fragmentos peptídicos de fibroína (Cha et al 2017). Por último, en otro ejemplo, destaca el trabajo de Tang-Schomer y col., en el que se describe la obtención de interfaces neurona-electrodo basados en films de fibroína para la estimulación crónica de la superficie cortical (Tang-Schomer et al 2014a). Para testar la compatibilidad de la fibroína en este formato, los ratones empleados fueron craneotomizados y sobre la superficie cortical expuesta se colocaron films de fibroína. El análisis de la respuesta inflamatoria en el tejido, reveló una presencia de células astrocitarias (GFAP+) similar a la de los animales control, en los que únicamente se realizó una craneotomía (Tang-Schomer et al 2014a). Estas evidencias enfatizan el carácter pobremente inmunogénico e inflamatorio de este biomateral en el tejido cerebral.

Mediante estudios inmunohistoquímicos y de microscopía electrónica, se ha demostrado que la simple inyección intracerebral de una solución salina es suficiente para desencadenar una bio- repuesta de tipo inflamatorio, acompañada de la muerte de poblaciones celulares, en el parénquima cerebral adyacente a la inyección (Lam et al 2014, Yang et al 2009a). La bio- respuesta transitoria observada en nuestro estudio debe estar probablemente relacionada con el procedimiento quirúrgico tan aparentemente invasivo como es la introducción de una aguja, aunque sea de forma breve, en el territorio cerebral. En nuestro estudio el diámetro de la aguja no fue superior 0,260 mm. Aunque diámetros menores podrían conducir a un menor daño tisular reduciendo ambos efectos (inflamatorio y citotóxico), también podrían limitar la eficacia del procedimiento al incrementar la mortalidad de las células trasplantadas que son sometidas a una mayor tensión superficial, y a atravesar conducitos de menor diámetro (Aguado et al 2012, Lam et al 2014), disminuyendo así el efecto terapéutico deseado. Es por tanto, que la elección de la aguja así como los parámetros de inyección deben de ser seleccionado cuidadosamente para minimizar los daños derivados de la cirugía y administrar tantas células viables como sea posible (Carmichael 2008). En cuanto a la supervivencia observada en el grupo de animales implantados con el biomaterial, ésta fue superior al 90 % y similar al grupo de animales inyectados con solución salina (PBS). La reducida mortalidad, se restringió a las primeras 72 horas post-trasplante y se atribuyó al propio procedimiento quirúrgico. En resumen, la tolerabilidad de los hidrogeles de fibroína implantados fue razonable, puesto que a las dos semanas post-implante no se observaron respuestas inflamatorias o de muerte celular de consideración, siendo similares en ambos grupos de animales (implantados con fibroína o PBS).

Una observación interesante de nuestro estudio fue la reducción progresiva del tamaño de los depósitos de fibroína en función del tiempo post-trasplante. En un estudio previo, la activación del sistema inmune fue considerada mayoritariamente responsable de la degradación de matrices de

153

fibroína implantadas intra-muscularmente en ratas inmuno-deficientes y nativas (Wang et al 2008b). Después de 8 semanas tras el implante, Wang y col., observaron un progresivo incremento del tamaño de poro en las matrices de fibroína cuando éstas fueron implantadas en ratones silvestres respecto al implante en animales inmuno-deficientes, sugiriendo que los macrófagos del sistema inmune de los animales silvestres contribuyeron a degradar progresivamente el biomaterial. En otro ejemplo, en el estudio de Szybala y col., se emplearon microesferas porosas de fibroína para la liberación de fármacos antiepilépticos en un modelo de epilepsia en ratas (Szybala et al 2009). Tras el trasplante intra-estriatal de las microesferas de fibroína en la fisura infra-hipocampal, observaron un incremento progresivo en el tamaño de los poros de las microesferas implantadas, lo que identificaron como una degradación parcial de este formato de fibroína ensayado. Por el contrario, la corriente ideológica más aceptada por diferentes autores es atribuir la degradación de la fibroína in vivo, a la acción proteolítica de diferentes proteasas presentes en los distintos tejidos (Balakrishnan & Banerjee 2011, Thurber et al 2015, Wang et al 2008b). En concreto, la quimiotripsina C (caldecrina), ha sido identificada en el cerebro de ratas (Tomomura et al 2002), y en estudios in vitro se ha demostrado que esta proteasa puede degradar un 70 % de la fibroína tras dos semanas de incubación (Li et al 2003). Con ciertas limitaciones, el curso temporal y la magnitud de la degradación parcial de fibroína determinado in vitro, fue similar al observado en nuestros estudios in vivo. Los productos de degradación de la fibroína por la acción proteolítica de la quimiotripsina C son principalmente aminoácidos: glicina, alanina, aspártico, glutámico, lisina y arginina (Li et al 2003), que pueden ser eliminados del organismo sin producir reacciones inmunológicas de relevancia o toxicidad celular (Thurber et al 2015), unas observaciones compatibles con la ausencia de muerte celular y/o inflamación en las últimas semanas post-trasplante de nuestro estudio, coincidiendo con la máxima degradación de la fibroína. Aunque en nuestro estudio no se examinaron los mecanismos responsables de la progresiva degradación de los depósitos de fibroína, nuestros hallazgos son incompatibles con una degradación del material mayoritariamente inducida por la activación de microglía y leucocitos periféricos, dado que la máxima reducción del volumen de los depósitos de fibroína ocurrió entre la segunda y cuarta semana post-trasplante (ver sección resultados 4.1.2. Figura 4.2.), un intervalo de tiempo caracterizado por la ausencia de poblaciones celulares de tipo inflamatorio en las condiciones ensayadas (ver sección resultados 4.1.2. Figura 4.3.). En ingeniería de tejidos la degradabilidad de los biomateriales es un requisito deseable (Nair & Laurencin 2007), para una vez obtenido el efecto terapéutico deseado, el polímero sea eliminado del tejido. Sin embargo los periodos de reparación de los distintos tejidos suelen ser variables, por lo que las tasas de degradación de los biomateriales ensayados deben de poder ajustarse a los requisitos de cada aplicación (Lu et al 2011). En nuestro caso, la tasa de degradación de los hidrogeles de fibroína fue adecuada para conseguir el efecto terapéutico logrado en esta tesis doctoral.

En nuestro trabajo el implante de fibroína se realizó en el estriado. Tal y como se describió en la sección de resultados, los núcleos caudado y putamen forman parte del estriado dorsal, el

154

principal componente de los ganglios basales. La corteza, el estriado y el tálamo constituyen un circuito conectado anatómica y funcionalmente (cortico-estriado-talamo-cortical), en el que el flujo de información en bucles o “loops” especializados permiten el procesamiento de la información sensorimotora procedente de áreas específicas del cortex y a través del tálamo, también por conexiones específicas, devuelve la información procesada a las áreas corticales, actuando así como centro integrador de la información cognitiva y motora (Alexander et al 1990, Alexander et al 1986, DeLong & Wichmann 2009).

En cuanto a la contribución del estriado a la integración de la información sensorial y motora, ésta se relaciona con su papel en la modulación de la actividad cortico-espinal, que a través de proyecciones aferentes excitatorias, modula la actividad cortical vía proyecciones talámicas. (Sippy et al 2015). Así, el estriado junto con el cerebelo son considerados centros moduladores del control motor, ya que controlan y modulan la actividad motora que se inicia en la corteza facilitando los movimientos voluntarios, desde su planificación hasta su terminación, pasando por la ejecución y coordinación. Por tanto, es tal la implicación del estriado en varias funciones de integración cerebral, que cualquier posible daño en esta región necesariamente debería manifestarse en anormalidades del procesamiento sensorimotor y cognitivo. Por ejemplo, en pacientes con la enfermedad de Parkinson, caracterizada por presentar daño neuronal adscrito principalmente al estriado, los síntomas se asocian mayoritariamente con deterioros en el sistema locomotor, sin embargo, también se encuentra bien establecido que presentan déficits sensoriales de relevancia (Hillen & Sage 1996, Koller 1984, Snider et al 1976). En modelos animales de la enfermedad de Parkinson, la pérdida progresiva de neuronas dopaminérgicas en la vía nigroestriada se asoció con alteraciones en el equilibrio y la coordinación motora que fueron examinados empleando los mismos tests de comportamiento que en nuestro estudio; el test del cilindro y de la rejilla (Fleming et al 2013, Pothakos et al 2009). En 2009, Choi y col., demostraron cómo la inyección intraestriatal de lipopolisacárido (LPS), indujo una fuerte respuesta inflamatoria microglial, que condujo a la muerte y degeneración de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra (Choi et al 2009), presentándose déficits sensorimotores en los animales examinados mediante el test de la rejilla y el rotarod. Por otro lado, la mera inyección de mediadores pro- inflamatorios en el cuerpo estriado (prostaglandina D2 y el agonista A2 del tromboxano), y la consecuente activación de la microglía, provoca el deterioro en el comportamiento motor de animales (Costall et al 1985, Yagami et al 2004). Dado que más allá de las primeras 72 horas post-trasplante no observamos déficits de comportamiento con ambos tests funcionales, no parece probable que los dépositos de fibroína en el estriado estén originando daños en esta estructura o en regiones adyacentes, que puedan comprometer el flujo de información sensorimotora (ver sección resultados 4.1.3.Figura 4.5. D, panel ii), sino que la escasa biorespuesta tisular observada en esas primeras horas sea la causante de los déficits en la coordinación sensorimotora de los animales, examinados mediante el test de la rejilla. Aun cuando el estriado no parece jugar papel alguno en modular la transmisión de información sensorial a nivel talamo-cortical, contrariamente

155

se han obtenido evidencias en pacientes y animales que avalan el papel del estriado en dicha modulación. Por ejemplo, en pacientes de Huntington, la neurodegeneración afecta especialmente a las neuronas del estriado durante las fase iniciales de la enfermedad, propagándose en estados intermedios y avanzados a otras estructuras cerebrales (Vonsattel et al 1985). Es durante esta fase inicial cuando la mayoría de los pacientes muestran un incremento anormal de la latencia en los potenciales evocados somatosensoriales (De Tommaso et al 2011) así como una reducción de la amplitud de los mismos (de Tommaso et al 2016). Así, aunque ningún componente de la onda evocada por el estímulo sensorial es generada en el estriado (Valeriani et al 2009), la disminución en la respuesta sensorial evocada se relaciona con déficits en la integración sensorimotora a nivel de este ganglio basal (Abbruzzese & Berardelli 2003). En concordancia con estos hallazgos, en un modelo animal de la enfermedad de Huntington, inducido mediante la inyección unilateral de ácido