Competitividad sexual de las moscas mutantes

Los resultados obtenidos de la prueba de competitividad para brless muestran que los machos mutantes mostraron una menor competitividad sexual en relación a los machos silvestres (RSI por debajo de 0.5); los machos Brush con relación a los machos silvestres tuvieron un desempeño sexual similar (RSI de 0.511); mientras que para los machos red body, tuvieron una mayor competitividad sexual con un RSI de 0.61, es decir, las hembras tuvieron un tendencia a aparearse con mayor frecuencia con machos red body, que con machos de la cepa silvestre (Cuadro 8).

Cuadro 8. RSI promedio ± error estándar en las diferentes cepas.

Cepa SS MS RSI prom

Error Est.

Brless 9.5 7.5 0.407a 0.193

Brush 10.5 11 0.511a 0.035

red body 6.5 10.5 0.611a 0.039

SS cruza de silvestre X silvestre (promedio)

MS cruza de mutante X silvestre (promedio)

La t-student aplicada a los valores de RSI de los diferentes tipos de mutantes obtenidos en este estudio, no mostraron diferencias estadísticamente significativas (P > 0.05) entre la competitividad de los machos brless y Brush (t = 0.53; gl = 2; P = 0.69); Brush y red body (t = 1.9; gl = 2; P = 0.307) y brless y red body (t = 1.03; gl = 2; P = 0.49).

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6. DISCUSIÓN.

El conocimiento de la genética de los organismos plaga puede ser aprovechado para desarrollar u optimizar los métodos control y erradicación, como es el caso de la TIE. Como se desprenden los antecedentes con otro insecto plaga C. capitata, en el que se acumuló gran cantidad de información acerca de las variantes genéticas, su forma de transmisión (herencia) y mapeado de los mismos, antes de la construcción de la línea sexada genéticamente (Rössler y Rosenthal, 1992), permitiendo separar los sexos previo a la liberación, dado que las hembras son consideradas nocivas por los intentos de oviposición sobre frutos (Franz, 2005) y además, se han disminuido los costos generados en el proceso de cría.

En A. ludens el conocimiento genético, sobre mutantes morfológicos y bioquímicos es limitado y muchos programas de investigación han hecho hincapié en la necesidad de inducir mutantes para este fin (Robinson et al., 1999). Normalmente las mutaciones en un organismo pueden ocurrir de forma espontánea y/o inducida, como algunas de las encontradas en A. ludens (Flores- Garcia et al., 2010). Sin embargo, debido a que la aparición espontánea de mutantes ocurre en frecuencias bajas y en periodos de tiempo amplios, es necesario desarrollar una metodología de mutagénesis inducida con la que se acelere el proceso de búsqueda de mutantes para disponer de un mayor número de estos, y así poder generar el mapa cromosómico y seleccionar aquellas variantes con mayor potencial para introducir re-arreglos cromosómicos en una cepa.

58 La elección del mutágeno a utilizar depende del tipo de mutación que se desee y la inversión de tiempo empleado en la búsqueda del mismo (Greenspan, 2004). Compuestos como el metasulfonato de etilo (EMS) pueden provocar

pérdidas, mutaciones puntuales y ocasionalmente otros rearreglos

cromosómicos (Pastink et al., 1991), por lo que ha sido utilizado de manera exitosa para inducir diversas mutaciones en cepas de Drosophila sp. (Hsiao-Pei et al., 2001; Greenspan, 2004).

Para el desarrollo de una metodología de este tipo, hay que tomar en cuenta varios factores, como la concentración del compuesto, las propiedades físico- químicas del mismo y de las características intrínsecas del organismo, como la edad, sexo y su composición genética, al momento de ser tratados con el mutágeno (Klaassen y Watkins, 2005). En este sentido, Busch-Petersen et al. (1986) sugirieron tres criterios que deben ser considerados para un tratamiento mutagénico con EMS en C. capitata. En primer lugar el EMS tiene que ser aplicado de manera uniforme a todos los machos tratados y deberán ser capaces de inducir un nivel predecible de la fertilidad hacia las hembras no tratadas con las que se apareen; segundo, el tratamiento no debe tener efectos adversos sobre la supervivencia y la conducta de apareamiento de los machos tratados; y por último debe de existir una relación entre la concentración de

EMS y el nivel de letalidad inducida en la F1. También hay que considerar la

duración e intensidad de la exposición, así como la ruta por la que el compuesto ingresa a los organismos es otro factor importante debido a que contribuye a modular la naturaleza de los efectos provocados (Ramos, 1994). Por lo anterior, es recomendable iniciar con la exploración de un intervalo

59 amplio de concentraciones en donde aumente la probabilidad de obtener un marcador genético (mutación) e inducir una gran cantidad de marcadores para seleccionar los más viables para fines de mejorar la eficiencia de la TIE sin que el efecto de la mutación altere el desempeño reproductivo del organismo. Se han evaluado diferentes métodos de tratamiento con el EMS, tanto en D. melanogaster (Ramos, 1994; Greenspan, 2004), como en C. capitata (Busch-

Patersen et al., 1986). En este sentido, el método por micro inyección empleado en este trabajo representó una alternativa viable en el que se redujo considerablemente la cantidad del compuesto utilizado (1.5ml por cada concentración), así como, la cantidad de compuesto que se inyectó a cada mosca (50 µl), por lo que la cantidad de residuo que se desechó al ambiente fue menor, inactivándolo previamente con Tiosulfato de Sodio. La aplicación por microinyección del compuesto EMS tiene una acción directa sobre las gónadas del macho con lo que hay mayor probabilidad de afectar el ADN de las espermatogonias, que darán origen a los espermatozoides; esto permite inyectar pocos organismos (50 moscas por concentración), con la expectativa de que el compuesto alcance el tejido blanco, a diferencia de los otros métodos donde la administración es de manera indirecta (en relación con las gónadas), y se utiliza una mayor cantidad de organismos y por consiguiente más cantidad del compuesto debido a que la distribución del compuesto debe ser uniforme, además de que la sustancia tóxica se distribuye en casi todo el cuerpo del insecto para llegar a las gónadas (hemolinfa, sistema digestivo, y respiratorio), aumentando la posibilidad de causar afecciones a nivel sistémico y reduciendo la supervivencia de los organismos tratados.

60 El tratamiento fue realizado solamente inyectando machos debido a que la información genética que ellos portan es reparada por la maquinaria de las hembras, la cual es necesaria para la formación y desarrollo de un cigoto. Por el contrario, si el tratamiento hubiera sido a hembras cabe la posibilidad de que el EMS dañe a dicha maquinaria y no se obtenga descendencia; además se espera que las mutaciones que pueda tener la progenie sean originadas por errores producidos en el ADN del macho o en los intentos de reparar el ADN de los machos por las hembras.

En las dos curvas de dosis-respuesta mostradas en la figura 10, se diferenció la proporción de organismos sobrevivientes a un tratamiento de EMS a las 216 horas después del tratamiento (los machos se inyectaron a las 24h de edad, por lo que habían transcurridos 10 días); el Índice de Sobrevivencia (IS) es una herramienta fundamental en el estudio genético y fisiológico a la exposición del compuesto, ya que es el primer indicador de un efecto tóxico al organismo, por lo que facilita la selección de concentraciones a evaluar. Se evaluó el efecto a la edad de 216 h porque es una etapa crucial ya que las moscas sobrevivientes alcanzaron la madurez sexual (240 horas) y fueron las que se cruzaron para

obtener una F1.

Cada línea de tendencia observada corresponde a cada uno de los diferentes testigos (con y sin inyección); el primer testigo (agua destilada inyectada) fue usado para estimar el efecto del EMS, mientras que el segundo (no inyección) fue usado para verificar si el método de inyección causaba algún tipo de estrés. La tendencia general de la gráfica corresponde a un efecto sub-letal en donde

61 ninguna de las concentraciones eliminó, a las 216 horas después de la inyección, al total de machos inyectados.

Las curvas observadas en ambas líneas de tendencia (Figura 10) son muy similares no importando el testigo, sin embargo, en la curva señalada para el Testigo sin inyección el IS de los lotes experimentales está por debajo de éste, lo que indica que el método de inyección afectó de igual manera a las moscas, sin importar la administración o no, de EMS. Aunque el EMS tiene un efecto negativo, la diferencia en las curvas muestra que la respuesta en los organismos sobrevivientes es homogénea y sólo están sobreviviendo los organismos que pudieron soportar el estrés producido por la inyección y la toxicidad del EMS sólo se hace evidente en la máxima concentración ensayada.

Para la tendencia del testigo con inyección, ocho concentraciones (de las diez probadas) presentan una mayor sobrevivencia con respecto al testigo, siendo la concentración de [0.14] y [9] mM las únicas que se encuentran por debajo del testigo, con esta tendencia se puede argumentar que la inyección está disparando una respuesta positiva en los diferentes lotes experimentales. La gran variación observada en los valores de los errores estándar, indicaron que estas moscas son genéticamente heterogéneas, es decir, que el efecto de la inyección hizo que algunos machos sobrevivieran mediante la activación de distintas rutas metabólicas de desintoxicación o la activación de otros procesos celulares y sistémicos que permitan un efecto positivo con respecto al testigo (Zhitkovich et al., 1996; Ramos, 1994). Pero, en algunas concentraciones como

62 en la 0.07 y 0.28 la variación disminuyó con respecto a las mismas concentraciones en la tendencia del testigo sin inyección, esto parece indicarnos que posiblemente sean puntos críticos donde el efecto de la inyección y del EMS no se compensan como en las otras concentraciones sino que actúan de manera sinérgica y aumentan la probabilidad de obtener organismos mutantes, este tipo de resultados se espera en poblaciones no seleccionadas para mutágenos, insecticidas o alguna otra forma de presión ambiental.

El IS es un buen indicador inicial en toxicología y es una referencia fundamental para ubicar la estrategia a seguir para provocar lesiones heredables en el ADN, por lo que se valuó si el daño ya reportado en los machos tratados es trasmitido a la siguiente generación y para esto los organismos tratados deben en primera instancia sobrevivir al tratamiento y conservar la capacidad de reproducirse.

Para evaluar si el daño provocado en los machos tratados es heredable a la siguiente generación se estimó la progenie por macho (promedio), esto para evaluar el efecto específico de acuerdo a la susceptibilidad de los machos tratados y también si la fertilidad y fecundidad era diferencial entre éstos. Este tipo de análisis permite evidenciar si los machos tienen un efecto negativo por el tratamiento o por el hecho de natural de que algunos machos nunca se reproducen. Ya que no todos los machos tuvieron la misma cantidad de hijos y que la composición de su progenie estuvo relacionada, en parte, con el daño provocado en células reproductivas. Esto nos indica una susceptibilidad de los machos tratados y el efecto reflejado en su descendencia.

63 Como se mencionó anteriormente, el empleo de mutantes es una alternativa para mejorar la TIE y reducir los costos que implican este proceso (Quintero et al., 2009). Por lo que un banco de variantes genéticas de A. ludens se

constituye como una fuente de material considerando la indispensabilidad de las mutaciones como parte central en los Sistemas de Sexado Genético, es deseable que estos marcadores mutantes tengan características de gran penetrancia y los mutantes obtenidos en esta investigación presentaron dicha característica.

El mutante denominado red body (rb) es un marcador genético interesante para fines prácticos, primero presenta una herencia mendeliana autosómica recesiva, lo cual quedó demostrado en los sistemas de cruza empleados y en

la pruebas de χ2 correspondientes (Cuadro 3). Sin embargo, en las cruzas de

prueba realizadas se puede observar un fenómeno interesante (Figura 18). En

la cruza donde la hembra es heterocigota con fenotipo silvestre ♀♀ rb+ / rb x

♂♂ rb / rb, la descendencia observada es más abundante que en las cruza

reciprocas ♀♀ rb / rb x ♂♂ rb+ / rb, donde la hembra es de cuerpo rojo. Una

explicación podría ser que existe algún tipo de interacción génica que hace que cuando la hembra es mutante la progenie disminuya considerablemente; otra explicación sería que la hembra rb tiene preferencia por los machos con fenotipo silvestre en comparación a una hembra silvestre, en donde aparentemente responde favorablemente al macho rb. Este evento puede ser observado en la prueba de competitividad sexual, en el que el índice RSI fue de

0.611 para la prueba de ♀♀ silvestres X ♂♂ silvestres X ♂♂ red body. Los

64 con los machos rb, incluso esto es confirmado con el promedio de copulas (Cuadro 8), cuando la hembra silvestre prefiere al macho rb representan casi el doble con respecto a los apareamientos con los machos silvestres. En cuanto a los parámetros de viabilidad y de atributos biológicos, se observa que esta cepa (rb) tiene un comportamiento muy similar a la cepa silvestre, es decir, la viabilidad y transformación de los estados inmaduros es prácticamente igual (Cuadro 6 y 7). Sin embargo podemos observar en el cuadro 7 que hay un aumento considerable en la fertilidad del mutante (0.91) y esto se refleja en el overall fitness (0.42) con respecto a Chis.

En el caso del marcador genético Brush, en cada cruza realizada se encontraron moscas silvestres y mutantes; este hecho indicó que el mecanismo de herencia para esta característica es un gen autosómico letal dominante, por lo que en homocigocis este carácter se pierde al no ser viable. Esto se comprobó dado el número de descendientes obtenidos en la cruza

Brush/Brush+ X Brush/Brush+, en donde la proporción esperada de 3:1 no se

presentó, sino que se obtuvo una proporción de 2:1 (Figura 21) , en el que los organismos mutantes siempre fueron heterocigotos (un alelo mutante y un alelo silvestre) y los homocigotos dominantes fueron eliminados de forma “natural”; este mutante juega un papel relevante ya que elimina de manera natural a un porcentaje de la población; sin embargo, ese porcentaje de la población que es afectada solamente representa el 25% del total, mientras que el resto de la población está constituido por heterocigotos con una proporción del 50% y por homocigotos recesivos con una proporción del 25% (Tamarin, 2004). En cuanto a la viabilidad y a los atributos biológicos, la cepa Br fue la que tuvo valores

65 más bajos en comparación con rb, brless y la cepa silvestre chis (Cuadro 6 y 7). Se asume que esta diferencia es debido al porcentaje de la población que se pierde por el tipo de herencia, la formación de larvas es mucho menor, por lo que se puede determinar que la acción del gen letal dominante ocurre en las etapas tempranas del desarrollo larvario, esto quedó demostrado al observar la viabilidad larvaria y la transformación huevo-larva (Cuadro 6 y 7) y esto también se reflejó en la viabilidad de pupas y en los adultos obtenidos (Cuadro 6). En cuanto a la competitividad sexual, el RSI obtenido indicó que la hembra (silvestre) no distingue entre el macho Brush y el macho silvestre, por lo que se asume que ambos machos tienen la misma probabilidad en el éxito de apareamiento (Cuadro 8).

Los organismos del marcador brless presentan una expresión variable, dado que no presentan cerdas o están mal formadas en comparación con las cerdas de los individuos de la cepa silvestre (Figura 23) y el mecanismo de herencia es de tipo autosómico recesivo quedando demostrado en las cruzas realizadas (Cuadro 5). A diferencia de Brush y red body, en la competencia sexual los machos brless no tuvieron una ventaja aceptable ya que el índice RSI fue de 0.407 (Cuadro 8), este hecho indicó que los machos silvestres tuvieron mayor ventaja en los apareamientos. En cuanto a la viabilidad se encontró que los organismos de esta cepa presentan una viabilidad menor que chis y rb, pero mayor a Br (Cuadro 6); y en cuanto a los atributos biológicos se observa que tienen una fertilidad igual a Brush pero en la transformación huevo-larva el valor es mayor, debido a que en esta fase del ciclo de vida se activa el gen letal de Brush; y por consiguiente el valor de Overall fitness aumenta (Cuadro 7).

66 Este marcador al igual que Brush puede ser aprovechado para complementar el banco de información genética y para mapear los genes ya conocidos y los que por primera vez son reportados en este trabajo.

Los adultos del mutante red bdy (rb) tienen mayor probabilidad de aplicación para mejoramiento de la TIE, dado que presentan algunas características relevantes para su aplicación; como tener una herencia mendeliana de tipo recesiva; viabilidad y atributos biológicos que son similares a los que poseen los organismos de la cepa silvestre (Zepeda-Cisneros et al., 2007). Además de que, a diferencia de Brush (Br), no requiere de arreglos complejos para mantenerse esta cepa, pues solo se mantiene la cepa entrecruzándose, y para poder mantener estable a un gen letal dominante se requiere de un sistema mucho más complejo, de tal manera que se tenga un rearreglo cromosómico (ya sean inversiones pericéntricas o paracéntricas) que permita no recobrar eventos viables de recombinación y se pueda mantener este gen (García, 2006). En Drosophila melanogaster se emplean cromosomas balanceadores, los cuales poseen múltiples inversiones a lo largo de los cromosomas, con lo que se evita la homocigocidad entre los alelos mutantes (García, 2006). Y con respecto a los individuos de la cepa bristle less (brless), aunque presentan un tipo de herencia similar (autosómico recesivo), los valores de los atributos biológicos fueron menores a rb y a la cepa silvestre chis, suficiente razón para descartarlo del programa de sexado genético.

Estudiar distintos marcadores mutantes ofrece la oportunidad de desarrollar estudios de genética sobre esta especie de mosca, para generar el

67 conocimiento necesario que permita entender mejor esta especie, ya que los análisis genéticos de Anastrepha se han limitado a la detección de variabilidad en poblaciones naturales y su distribución (Aluja, 1994). En el presente trabajo, fue posible generar tres mutantes caracterizados por diferencias morfológicas

de A. ludens en la F2 después de tratar a los machos progenitores con EMS.

Dos de estos mutantes presentan cerdas modificadas (Br y brless) y los de la otra cepa presentan un color de cuerpo diferente (rb). De acuerdo con los mecanismos de herencia para cada mutante se puede identificar y caracterizar la cepa que podría ser incorporada a un programa de sexado genético para criar machos masivamente, siempre y cuando el patrón de herencia sea del tipo recesivo y reúna las características requeridas para su funcionamiento (Zepeda-Cisneros et al., 2007), por lo que es necesario seguir explorando y evaluando otros atributos biológicos de las cepas mutantes.

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7. CONCLUSIONES.

Se obtuvieron mutantes en adultos de Anastrepha ludens, obtenidos a partir de los machos progenitores tratados con EMS.

Se estableció el rango de concentraciones que puede ser utilizado como un parámetro de referencia para la inducción de mutantes.

Se describen y reportan tres tipos de mutantes que pueden ser utilizados como marcadores genéticos:

Red body (rb), que cambia la coloración del cuerpo de la mosca a rojo.

Brush (Br), induce un engrosamiento y reducción de la longitud de las sedas del cuerpo.

Bristleless (brless), se caracteriza por una alteración estructural variable de las sedas corporales.

Se determinó que el número y tipo de genes involucrados en la mutación fueron:

rb un gen autosómico recesivo.

Br un gen autosómico dominante y letal en homocigocis. brless un gen autosómico recesivo.

De acuerdo con los atributos biológicos, el fitness de las cepas indica que: red body > cepa silvestre (Chis) = brless > Brush.

Los machos red body tuvieron mayor competitividad sexual que los machos silvestres, mientras que los machos Brush fueron de igual competitividad que los machos silvestres; y los machos brless fueron menos competitivos que los machos silvestres.

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8. BIBLIOGRAFÍA.

Aluja, M. 1993. Manejo integrado de la mosca de la fruta. Ed. Trillas. México, pp.252

Aluja, M. 1994. Bionomics and management of Anastrepha. Annual Review of Entomology, 39: 155-178.

Arellano A. R. O. 2002. Drosophila como modelo in vivo para evaluar el potencial