El Colegio de la Frontera Sur
Obtención de mutantes con Metanosulfonato de Etilo
(EMS) en Anastrepha ludens L. (Diptera: Tephritidae).
TESIS
Presentada como requisito parcial para optar al grado de Maestro en Ciencias en Recursos Naturales y Desarrollo Rural
Por
Hugo Alberto Ríos Pérez
AGRADECIMIENTOS.
Quisiera agradecer a mi tutor de tesis Dr. Jorge Toledo Arreola por su aportación académica en mi vida, así como por su paciencia y apoyo brindado durante mi estancia en el posgrado, gracias.
A los integrantes de mi comité tutoral por sus aportaciones en este trabajo: a la Dra. Cristina Silvia Zepeda Cisneros por la oportunidad de desarrollar este trabajo dentro de su laboratorio, así como la oportunidad de conocerla como persona e investigadora. A la Dra. Patricia Ramos Morales por su experiencia compartida en el mundo de las moscas y de la genética, gracias por todo. Al Dr. Edi Alvaro Malo Rivera por tus aportaciones en el escrito de la tesis y por dejarme conocer un área más del mundo de los insectos, gracias.
También quisiera agradecer a todo el personal que integra el ECOSUR unidad Tapachula, tanto administrativo como docente por compartir sus conocimientos y experiencias y hacer de esa unidad un lugar muy agradable. En especial a Rosalba Morales Pérez por el apoyo logístico y administrativo brindado durante el posgrado, además de su amistad brindada. A mis amigos y compañeros de la maestría: Javier, Yasmin, Cuahtémoc, Milka, Ana, Julieta, Carlos, Jorge, Mau y Alfredo
También agradezco al personal del Laboratorio de sexado genético ubicado en la Planta Moscafrut, quieres me brindaron su amistad y sus conocimientos sobre las moscas.
Agradezco al CONACYT por la beca otorgada durante el desarrollo de mis estudios de postgrado.
Por último agradezco enormemente al Colegio de la Frontera Sur por permitirme la oportunidad de crecer dentro de ella, reconociendo así su gran potencial en el desarrollo científico-social de nuestro sureste mexicano.
DEDICATORIA
Este trabajo está dedicado con especial cariño a mis padres: Basilio Luis Ríos Ramírez y a Juana Pérez Venero quienes han sido un ejemplo de vida tanto social como académico, estoy muy agradecido por lo que me han enseñado. Los quiero mucho.
A mis hermanitos Anny Edith Ríos Pérez y Juan Luis Ríos Pérez por su apoyo incondicional y el ejemplo que han sido para mí. Seguiremos caminando juntos por las sendas del infinito.
A toda la familia Ríos (tíos, primos, sobrinos y anexos) con especial cariño a mi tío Noé Ríos y con inefable recuerdo para mi tío Enrique Ríos donde quiera que estés…
A mis mejores amigos, Eduardo Melendez Uribe, que desde la prepa hemos compartido muchas cosas; a mis casi cuates de la facultad Marco Tulio Tejeda y Pablo Ledezma,
A Armando, Lety y en especial a Linda Beatriz por el apoyo brindado desde que comencé esta aventura. A toda la gente que he conocido y me ha acompañado y apoyado en esta vida. Esto es para ustedes.
ÍNDICE
Pág.
RESUMEN……….. I
1. INTRODUCCIÓN………..…. 1.1 El Manejo integrado de plagas (MIP) y sus
perspectivas.………... 1.2 El Manejo Integrado de Plagas en áreas extensas……….…. 1.3 El uso de insectos estériles. Control autocida………. 1.4 Bases de la Técnica del Insecto Estéril (TIE)……… 1.5 El Desarrollo de Cepas Sexadas Genéticamente (CSG)……… 1.6 Alcances de la Toxicología en la inducción de mutantes…………. 1.6.1 Toxicología genética……….. 1.6.2 Mutagénesis……….. 1.6.3 Utilización del sistema de Mutaciones Letales recesivas
ligadas al sexo para producir mutantes……… 1.7 Metanosulfonato de Etilo (EMS)………... 1.8 Anastrepha ludens Loew (Tephritidae)………. 2. JUSTIFICACIÓN……….. 3. OBJETIVOS……….. Objetivo general………. 1 1 2 4 8 10 12 13 14 15 16 18 21 22 22 Objetivos particulares……….. 22 4. MATERIALES Y MÉTODOS……… 4.1 Características del mutágeno……….. 4.2 Obtención y manejo de adultos de A. ludens de la cepa silvestre
Chis……….
4.3 Microinyección de EMS……….
4.4 Obtención de la F1……….…….
4.5 Obtención de la F2………...
4.6 Manejo de los organismos mutantes………...…………. 4.7 Determinación del patrón de herencia de los mutantes…………..
23 23 23 26 27 28 29 29
4.8 Viabilidad y atributos biológicos de las cepas mutantes…………... 4.9 Competitividad Sexual de machos de las cepas mutantes………… 4.10 Análisis de datos………. 5. RESULTADOS……….. 5.1 Curva de dosis respuesta……….. 5.2 Progenie por macho……… 5.3 Descripción de los mutantes obtenidos..………. 5.3.1 Mutación red body (rb)………. 5.3.2 Mutación Brush (Br)……….. 5.3.3 Mutación bristleless (brless)……….. 5.4 Viabilidad y transformación de las cepas mutantes y de la cepa silvestre (Chis)……… 5.5 Competitividad sexual de las moscas mutantes………..
30 31 33 36 36 37 40 40 44 48 52 56 6. DISCUSIÓN……….. 57 7. CONCLUSIONES……… 68 8. BIBLIOGRAFÍA……….. 69
RESUMEN.
Uno de los pilares de nuestra economía nacional es el sector agrícola y a menudo se ve afectada por diversos factores, como la presencia de plagas. En México existe un complejo de plagas de importancia económica. La mosca mexicana de la fruta
Anastrepha ludens es una de las especies que conforman este complejo, por lo que
se requiere la implementación de estrategias para evitar su propagación. El estudio de la genética de los organismos plagas puede ser utilizado para optimizar métodos de control como la Técnica del Insecto Estéril (TIE). En experiencias previas como el caso de Ceratitis capitata se ha logrado la construcción de cepas sexadas genéticamente (CSG) mejorando así, la eficiencia de la técnica, esto se logró al acumular gran cantidad de información genética sobre esta especie y por la gran diversidad de marcadores mutantes (fenotípicos y metabólicos) que se han encontrado, los cuales son fundamentales en el desarrollo de estas CSG. Por lo que es prioritario desarrollar metodologías que nos permita obtener organismos mutantes en A. ludens de manera eficiente. En Drosophila melanogaster, se utilizan técnicas basadas en la construcción de familias derivadas de organismos expuestos a mutágenos. La endogamia de las familias recobradas incrementa considerablemente la probabilidad de que se generen y aíslen organismos mutantes. Además, del uso de sustancias como el metanosulfonato de etilo (EMS) aumenta la probabilidad de obtención de mutantes. El objetivo de este trabajo fue inducir mutantes de A. ludens mediante la producción de familias a partir de machos tratados con EMS. Evaluando una serie de diluciones sucesivas de EMS a partir de una solución patrón de 9 mM, se
inyectaron machos (adultos), que posteriormente fueron cruzados con hembras vírgenes no tratadas y se obtuvo su descendencia. Se aislaron tres nuevos marcadores genéticos morfológicos: uno de color de cuerpo y dos de cerdas. Los cuales fueron nombrados red body (rb), Brush (Br) y bristleless (brless) respectivamente. Las pruebas para determinar el patrón de herencia sugieren que rb es originado por un gen autosómico recesivo, Br es causado por un gen autosómico dominante que es letal en homocigosis , y brless depende también un gen autosómico pero recesivo. Una vez que se estabilizaron estas líneas mutantes fueron evaluados algunos atributos biológicos y la competitividad sexual para cada una de ellas; en condiciones de laboratorio con respecto a la cepa Chis (fenotipo silvestre) mostrando diferencias con respecto a ella, red body presenta viabilidad y competitividad mayor que Chis; en el caso de Br la baja viabilidad mostrada es debido a su patrón de herencia y una competitividad igual que la cepa de fenotipo silvestre; y para brless la viabilidad y la competitividad son menores en comparación con la cepa Chis. La cepa rb puede ser de utilidad en la TIE. Sin embargo, es necesario realizar las pruebas para evaluar otros parámetros de calidad de los adultos como longevidad, dispersión y otras características de los mutantes para evaluar su uso potencial en el control de la mosca de la fruta A. ludens.
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1. INTRODUCCIÓN.
1.1 El Manejo integrado de plagas (MIP) y sus perspectivas.
La producción agrícola es uno de los sectores de la economía nacional que a menudo se ve afectada por diversos factores, entre los que se encuentran los insectos plaga, las malezas, enfermedades y nematodos que reducen la producción agrícola al dañar los cultivos, causando pérdidas que alcanzan entre el 30 y 40 % de la producción mundial de alimentos, fibras, etc. (Thomas, 1999).
En México, el sector hortícola con sólo 3.7% de la superficie aporta el 23.3% del valor de la producción del sector agrícola (Avendaño y Schwentesius, 2008). Se estima que cada año se cultivan alrededor de 1.7 millones de hortalizas y frutales que producen 12 millones de toneladas con un valor comercial de 4,500 millones de dólares, por tal motivo la protección de la sanidad vegetal es un factor decisivo en la comercialización tanto nacional como internacional (Trujillo, 2008).
El desarrollo de estrategias para la prevención, control y erradicación de las plagas que afectan a la agricultura de manera continua es prioritario y en el diseño de éstas, es recomendable evitar efectos indeseables al medio ambiente, como el uso de insecticidas. Utilizar el conocimiento ecológico para el mantenimiento y regulación de los sistemas agrícolas propicia el uso adecuado y sostenible de los recursos naturales; fortaleciendo así, las medidas fitosanitarias enfocadas a proteger la economía del sector agrícola nacional, como con el Manejo Integrado de Plagas (MIP); con estas acciones se ha
2 buscado mantener a las poblaciones de la plaga en niveles que no causen daños económico (Barrera et al., 2008).
Un complejo de plagas conocido como moscas de la fruta representa uno de los más serios problemas para la hortifruticultura a nivel internacional (White y Elso-Harris, 1992). Al respecto, el Gobierno de México tiene una larga historia en el control de moscas de la fruta, utilizando algunos de los métodos propuestos por el MIP (Metcalf y Luckmann, 1994), como el uso de la Técnica del Insecto Estéril (TIE) (control autocida) (Reyes et al., 2000), complementado con otros conceptos como la aplicación del de áreas libres de moscas de la fruta, establecimiento de acuerdos cooperativos para la operación regional de programas para la erradicación de la mosca del mediterráneo, construcción y operación de la planta de producción de moscas estériles (género Anastrepha) y parasitoides y el Centro Internacional de Capacitación sobre Moscas de la Fruta (Trujillo, 2008).
1.2 El Manejo Integrado de Plagas en áreas extensas.
Los sistemas agrícolas o agroecosistemas no se encuentran aislados de otros sistemas del mismo tipo o de ecosistemas naturales, por lo que es necesario considerar a estos sitios aledaños para combatir la plaga (Enkerlin y Lindquist, 2008). El manejo integrado de plagas en áreas extensas se define como el control de una o varias plagas de insectos de importancia en un área que involucra una región geográfica amplia de numerosos productores del mismo cultivo o cultivos similares (Lindquist, 2000). En otras palabras, el enfoque central del MIP en áreas extensa abarca toda la población de insectos en un
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área delimitada (Klassen, 2005). Reconociendo la existencia de
metapoblaciones, compuestas de poblaciones locales (Toledo, 2007). Para cubrir estas necesidades en el combate de las moscas de la fruta, en México surge la Campaña Nacional contra Moscas de la Fruta, integrada por el Programa Mosca del Mediterráneo (MOSCAMED) que tiene como misión prevenir, controlar y erradicar los brotes de la mosca del mediterráneo en territorio mexicano y cooperar con los países vecinos para formar la barrera de contención de la plaga en las fronteras de México y Guatemala para impedir el desplazamiento de la plaga hacia áreas libres de la región (SENASICA, 2012); el Sistema de Trampeo Preventivo contra Moscas de la Fruta y el Programa Control de Moscas Nativas de la Fruta del género Anastrepha (MOSCAFRUT) (Trujillo, 2008). Basado en la amplia perspectiva del manejo de plagas que incluye el uso de la TIE en Anastrepha ludens y A. obliqua, además se utiliza el control biológico a través del parasitoide Diachasmimorpha longicaudata que es altamente eficiente por su selectividad para combatir a las moscas de la fruta (SENASICA, 2012a).
En sentido específico el programa Control de Moscas Nativas de la Fruta (Anastrepha) está dirigido a cuatro especies de importancia económica, como A. ludens, A. obliqua, A. striata y A. serpentina (Hernández-Ortiz, 1996). Su
objetivo es mejorar la competitividad de los productores de mango, guayaba y cítricos, de tal manera que permitan generar valor agregado a los productos agrícolas, mediante la mejora o conservación de estatus fitosanitarios (SENASICA, 2011). Estos programas consideran la implementación de métodos que requieren de una cuidadosa planificación y una organización
4 bastante coordinada (Vreysen et al., 2006) que se apoya en sistemas de información geográfica, teledetección, modelos matemáticos y genética de poblaciones (Klassen, 2005). Además de incluir zonas de cultivo, zonas biogeográficas donde habitan plantas que sirven como hospederas alternantes, lugares de hibernación (o estivación) e incluso lugares que sirven como vías de entrada y desplazamiento de la plaga (Hendriks, et al, 2002; Enkerlin y Linquist, 2008).
1.3 El uso de insectos estériles. Control autocida.
Los conocimientos sobre el comportamiento de las moscas de la fruta durante su apareamiento, son utilizados para su propia auto-destrucción tomando ventaja de esta conducta. Esta técnica se basa en la cría, esterilización y liberación de insectos en estado adulto en el campo para competir por cópulas con los insectos silvestres. Esta técnica recibe el nombre de método autocida en el control de plagas. Los insectos liberados competirán por apareamientos con los miembros de una población silvestre normal, lo que resultará en apareamientos con machos estériles que reducirá el número de huevos fértiles que producen las hembras. En los insectos genéticamente alterados al aparearse con insectos normales transmiten rasgos detrimentales en las generaciones posteriores; y también los insectos pueden ser liberados para interrumpir la reproducción por la trasferencia física de agentes biológicamente activos (Knipling, 1979; Robinson, 2002).
5 En 1940 Serebrovskii señaló que una translocación entre segmentos de dos cromosomas causa un apareamiento anormal de cuatro cromosomas durante la meiosis en los homologos heterocigotos, resultando en la formación de gametos con duplicaciones y deficiencias letales, así como en esterilidad parcial en el heterocigoto con la translocación (citado en Klassen y Curtis, 2005). Aunque la esterilidad parcial tiende a ser transmitida de una generación a otra, en estado homocigoto estas translocaciones son viables y los organismos tienen una meiosis normal, y son completamente fértiles. Serebrovsky sugirió que en condiciones de heterocigosis negativa, la selección natural favorecería a cualquier tipo de cromosoma que estuviera inicialmente presente en la mayoría de los organismos, con un punto de equilibrio inestable y tendría una frecuencia de aparición del 50% si la viabilidad de los cariotipos heterocigotos es igual, por lo que la esterilidad en una población, sería la máxima (Klassen y Curtis, 2005). Serebrovsky determinó: (1) el grado en que la esterilidad podría seguir apareciendo en una población en generaciones posteriores a la liberación de individuos homocigotos translocados cromosomicamente. (2) la manera de mejorar el nivel de esterilidad mediante el uso de diferentes translocaciones, y (3) los efectos de la liberación de los machos sólo para evitar un aumento temporal de la población reproductiva (Klassen y Curtis, 2005).
La liberación de insectos portadores de una translocación deletérea podría ser la opción más efectiva y viable para producir letalidad, pues la característica sería trasmitida dentro de la población y eventualmente podría causar la muerte a los individuos de dicha población que portan los genes letales. Esto se practicó con Musca domestica L. y en Calendra granaría L.
6 Vanderplank y colaboradores, en la década de 1930 a 1940 desarrollaron un sistema de control de insectos en campo totalmente diferente, basado en la esterilidad de la cruza de especies diferente y en los híbridos resultantes. Con base en estudios de campo sobre Glossina morsitans donde se habían descubierto las sutiles pero inequívocas diferencias ente G. morsitans sensu stricto y G. swynnertoni Austen. Los apareamientos entre estas especies
tuvieron baja fertilidad (Corson, 1932; Potts, 1944; Vanderplank, 1944) y dieron origen a híbridos con genitales de apariencia distinta a las especies progenitoras. Los machos híbridos mostraron esterilidad total y las hembras híbridas eran parcialmente estériles (Klassen y Curtis, 2005). Por lo que se propuso que la esterilidad de las cruzas podría ser utilizada para el control de la mosca tsetsé (Vanderplank, 1944; Knipling, 1979).
Tomando como base las observaciones de Jackson (1945), quien mostró que hubo cruzamiento al azar entre las dos especies en el campo, Vanderplank organizó la recolección masiva de pupas de G. morsitans, liberando moscas
recién emergidas en un área de 26 km2 ocupada sólo por G. swynnertoni. El
resultado fue la desaparición de G. swynnertoni y debido a las condiciones climáticas del área G. morsitans también desapareció (Robinson, 2002).
Por otro lado, tomando como base en los trabajos de H. J. Müller en 1950 sobre mutagénesis inducida por rayos X en Drosophila melanogaster y sobre la letalidad en la progenie de estas moscas irradiadas debido a que se indujeron lesiones en el material genético. Knipling (1955) propuso el uso de la radiación ionizante para inducir esterilidad en el combate (autocida) de insectos
7 plaga y desarrolló los primero modelos teóricos para su aplicación (Knipling, 1955, 1979; Vreysen et al., 2006).
Cochlyoma hominivorax (el gusano barrenador de ganado) fue la primera
especie plaga que fue criado con una dieta artificial, lo que permitió que un gran número de gusanos barrenadores estén disponible para el estudio. La extrema agresividad sexual de los machos del gusano barrenador, así como el hecho de que las hembras se aparean sólo una vez, llevaron a Knipling (1955) a sugerir que, si la esterilidad sexual podía ser inducida en los machos, y si un gran número de estos podrían ser liberados en el campo, entonces la población del gusano barrenador sería menos numerosa y si la liberación se hace durante varias generaciones sucesivas, la densidad de población silvestre disminuirá y la relación entre el número de machos estériles a la de los machos fértiles silvestres aumentará considerablemente. También desarrolló modelos matemáticos simples para evaluar los efectos de la llamada Técnica del Insecto Estéril (TIE) y de los insecticidas sobre la dinámica de las poblaciones del gusano barrenador (Knipling, 1955). Al respecto, Bushland (1960) reportó que, hay casos en los que la irradiación produce mutaciones letales dominantes en el esperma que aún pueden penetrar en los huevos, por lo que la monogamia femenina no es un requisito en la TIE. Con esta estrategia se erradicó al gusano barrenador del ganado (C. homnivorax Coquerel) (Diptera: Calliphoridae) en la isla de Curacao al norte de Venezuela en 1963, y posteriormente en el Sur de los Estados Unidos y México (Knipling, 1979). Esta técnica se ha empleado para erradicar o para controlar distintas plagas al mantener su incidencia por debajo del umbral de daño económico (Zapater y
8 Camacho, 1993), como sucedió con la mosca de la cebolla, Delia antiqua que se ha controlado haciendo liberaciones de insectos estériles (Loosjes, 2000).
1.4 Bases de la Técnica del Insecto Estéril (TIE).
Los modelos teóricos han mostrado que la liberación sostenida, secuencial y sistemática de machos estériles podría eliminar por completo una población de insectos en unas pocas generaciones (Knipling, 1955). La técnica consiste en la producción de un gran número de insectos plaga en las instalaciones de cría especializada, la esterilización de uno o de ambos sexos y la liberación sostenida de los individuos estériles en cantidades suficientemente grandes para competir con la población silvestre (Vreysen et al., 2006). Así cuando los machos estériles se apareen con las hembras silvestres, éstas no producirán descendencia viable y con una tasa constante de liberación de insectos estériles, la población general descenderá durante varias generaciones (Kniplig, 1979).
Knipling (1979) menciona que hay varios puntos clave a considerar para la aplicación de la TIE:
- Los procedimientos prácticos para desarrollar una cría de insectos capaz de enfrentarse en el comportamiento y competitividad a poblaciones silvestres.
- Los métodos de inducción de esterilidad o cepas que posean defectos genéticos adecuados.
- Los machos liberados deben ser lo suficientemente competitivos en el apareamiento y en la transferencia del esperma para inhibir la reproducción de las hembras silvestres.
9 - Los insectos liberados deben ser distribuidos de tal forma que estén en competencia espacial con la población natural y puedan competir por las cópulas.
- Recabar información sobre la densidad, dinámica e incremento poblacional especialmente en el momento inicial del programa.
- El grado de infiltración de la plaga debe ser considerado ya que puede afectar la eficacia de la técnica.
- Un análisis crítico de la especie candidata, incluyendo costos, efectividad y efectos ecológicos de los métodos alternativos, es esencial para evaluar el beneficio y el valor de los procedimientos autocidas como complemento o reemplazo de otros métodos de control.
- El número necesario de insectos liberados para el control o eliminación de la plaga no debe ser excesivamente peligroso para los cultivos, animales o el hombre
Otro factor importante que ha sido trascendental para el éxito de esta técnica depende de la correcta identificación positiva de las poblaciones para determinar la relación de los insectos liberados en la población objetivo, razón por la cual es necesario poder distinguir entre los insectos liberados y los insectos silvestres (McCombs y Saul, 1992).
La TIE ha mostrado ser una alternativa confiable y es uno de los métodos no contaminante de control de insectos (Busch-Petersen y Kafu, 1989), ya que su funcionamiento es muy específico (a nivel de especie), no transfiere agentes exóticos al ambiente y tampoco introduce nuevo material genético a las
10 poblaciones existentes debido a que los organismos liberados no se pueden reproducir (Hendrichs et al., 2002).
Sólo es exitosa cuando es implementada en áreas extensivas (MIP en áreas extensivas) (Enkerlin y Lindquist, 2008). En esta técnica se han logrado avances técnicos que permiten su implementación en el control de varios insectos plaga. Un ejemplo de esto es el caso de Ceratitis capitata, en la que se han desarrollado métodos para separar sexos, esto se logró a través del uso de cepas sexadas genéticamente que permiten únicamente la producción de machos (Franz, 2005).
1.5 El Desarrollo de Cepas Sexadas Genéticamente (CSG).
Para llevar a cabo la construcción de estas cepas, son necesarios dos componentes básicos, primero una línea que exhiba un marcador genético morfológico y segundo, una serie de líneas con translocaciones reciprocas ligadas a los machos (Robinson et. al., 1999; Zepeda-Cisneros et. al, 2007).
Los marcadores genéticos con potencial para ser utilizados en el desarrollo de Sistemas de Sexado Genético deben:
- Presentar alta expresividad y penetrancia,
- Heredarse con un patrón simple o monogénico (herencia mendeliana), - Ser un carácter recesivo (aa), de fácil identificación y discriminación con
agentes inocuos y económicos ya que el objetivo final será la cría masiva de estas cepas.
11 Las mutaciones por translocación son inducidas mediante la aplicación de diferentes dosis de radiación iónica a pupas, con el objetivo de ligar el marcador genético seleccionado al cromosoma Y lo cual originará que la transmisión del marcador genético siga el patrón de herencia ligada al sexo. De esta forma al cruzar el macho translocado con hembras que porten una mutación recesiva para dicho marcador, la descendencia será de machos con fenotipo silvestre y hembras mutantes (Robinson et al., 1999) (Figura 1). Estos sistemas deben garantizar su estabilidad debido a que se utilizarán en la cría masiva de las moscas. En este punto entra otra forma de rearreglo cromosómico llamado inversión, el cual evita recobrar resultados viables de la recombinación entre los fragmentos homólogos y mantiene la estabilidad de las LSG (Franz, 2005).
Actualmente se han encontrado algunas mutantes espontáneas de A. ludens en la cría masiva (Flores-García et al., 2010) como la pupa color negro (bp), la cual se emplea para la construcción de una línea sexada genéticamente “Tapachula-7” (Meza et al., 2008) (Figura 1).
12 Figura 1. Esquema de cruzas para la inducción de una translocación utilizando como
marcador genético a black pupae (bp) (Tomado de Zepeda-Cisneros et al., 2007)
Para la inducción de mutaciones por inversión se requiere localizar al menos dos marcadores mutantes en el mismo cromosoma y se obtienen mejores resultados cuando se logran identificar tres (Zepeda-Cisneros et al., 2007). Por lo que es prioritario continuar con la búsqueda e inducción de marcadores mutantes en las diferentes especies donde se aplica esta técnica.
1.6 Alcances de la Toxicología en la inducción de mutantes.
La toxicología se encarga de estudiar los efectos nocivos que produce la exposición a sustancias químicas, biológicas o físicas en un sistema biológico
13 (Timbrell, 2002). Los efectos que una sustancia puede causar en un organismo son variados, puede afectar el metabolismo, diferentes estructuras del cuerpo o al material genético. Los cambios inducidos pueden ser transmitidos a la siguiente generación y llegar a establecerse a nivel poblacional. El daño que las sustancias pueden causar está ligado a la vía de entrada y depende del grado de absorción, metabolización y excreción (Klaassen y Watkins, 2005). También depende del mecanismo por el cual la sustancia interactúa con la molécula blanco, ya sea por sustitución de bases, formación de aductos, intercalación de moléculas entre los pares de bases, etc. (Brusick, 1987; Herrera, 2005). Las rutas de entrada de las sustancias químicas al organismo pueden ser por: ingestión, inhalación, absorción, contacto dérmico, vía intramuscular, intravenosa, intra-peritoneal y subcutánea. Una vez que la sustancia ha entrado al cuerpo, la siguiente barrera que se presenta es la membrana celular, misma que será superada por la sustancia, dependiendo de las características fisicoquímicas de esta última (Klaassen y Watkins, 2005). Una vez que el agente se encuentra en el interior de la célula, éste puede dañar directamente al ADN (agentes de acción directa) o bien, ser metabolizado y alguno(s) de sus metabolitos afectar el ADN (agente indirecto). Los agentes directos generalmente son compuestos alquilantes y sustancias electrofílicas (Misra y Waalkes, 2001), mientras que los agentes indirectos pueden ser de naturaleza variada.
1.6.1 Toxicología genética.
La toxicología genética se desarrolló a partir de los estudios realizados por Müller (1950) sobre la inducción de mutaciones génicas. Se considera como
14 agente genotóxico a aquel producto que tenga la capacidad de alterar la expresión, composición o arreglo del genoma de un organismo y que estas alteraciones sean heredables en el genotipo celular (Misra y Waalkes, 2001). Aunque algunos genotóxicos reaccionan directamente con el DNA y otros son resultado de la activación metabólica y el tipo de lesiones que pueden inducir depende del linaje de las células que sean afectadas (somáticas o germinales). Estos productos pueden inducir mutagénesis, teratogénesis o carcinogénesis (Winder, 1993).
1.6.2 Mutagénesis.
Los mutágenos son agentes físicos, químicos o biológicos capaces de inducir cambios heredables en el ADN. Las mutaciones que se inducen ocurren al azar, por lo que no es posible predecir en que gen o parte de una secuencia aparecerá la mutación. Esto debido a la sensibilidad y susceptibilidad del organismo expuesto (Timbrell, 2002). El que una célula expuesta a un mutágeno sobreviva, se reproduzca y herede las mutaciones adquiridas a las células hijas, depende del número, del tipo de cambios estructurales producidos por el mutágeno en el ADN y de la eficiencia de la célula para reparar este cambio (Klaassen y Watkins, 2005). Así, la probabilidad de que la lesión genética produzca un daño posterior, depende en última instancia de la naturaleza de la lesión, la capacidad que posee la célula de reparar, la oportunidad de expresar la alteración que se haya inducido y la capacidad del organismo de reconocer y suprimir la multiplicación de células aberrantes (apoptosis) (Misra y Waalkes, 2001; Klaassen y Watkins, 2005).
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1.6.3 Utilización del sistema de Mutaciones Letales recesivas ligadas al sexo para producir mutantes.
La prueba de Letales Recesivos Ligados al Sexo (SLRLT, Sex Linked Reccessive Lethal Test), en Drosophila melanogaster es la única metodología en insectos que ha sido utilizada de manera rutinaria por organizaciones reguladoras como la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA, Environmental Protection Agency), para detectar la presencia de sustancias peligrosas en el ambiente (Ramos, 1994), y para evaluar distintos mutagénos y carcinogénos (Zimmering et al., 1985). Por lo que en D. melanogaster esta metodología está estandarizada (Lee et al., 1983, Woodruff et
al., 1984).
La prueba de letales recesivos ligados al sexo, está diseñada para detectar la inducción de lesiones genéticas heredables en gran parte del genoma de Drosophila. Se requieren dos generaciones para la detección de letales
recesivos en el cromosoma X, el cual representa cerca del 20% de genoma completo. Se estima que aproximadamente de 700 a 800 de los 1000 loci del cromosoma X son susceptibles de ser alterados para dar origen a mutaciones letales recesivas (Lee et al., 1983). Es posible que este sistema de prueba (calibrado en D. melanogaster) pueda ser empleado en otros insectos para otros fines además de su uso predictivo en estudios de toxicología.
En este sistema (Letales Recesivos) hay que tener dos consideraciones: primero en cuanto al sistema de cruzas de las moscas y segundo sobre la
16 administración del mutágeno. Con respecto al primer punto, se cruzaran machos tratados (con mutágenos) con hembras vírgenes no tratadas. Las moscas recobradas de esta cruza se cuantifican y se les cultivan en familia, de manera que la endogamia se incremente y con ello, la probabilidad de que un gen letal se exprese. Mediante el empleo de marcadores genéticos morfológicos es posible establecer si el gen es autosómico o bien sí los cromosomas sexuales se encuentran involucrados, en cuyo caso se apreciará un sesgo en la proporción de sexos. También es necesario la presencia de un cromosoma balanceador, éste tiene múltiples inversiones a lo largo del cromosoma evitando que se recobren eventos viables de recombinación, por lo tanto, las moscas pueden sobrevivir con un gen letal en condición heterocigota (García, 2006).
Con respecto al mutágeno, este se puede administrar de diversas formas y en cada una de ellas se observarán ventajas y desventajas en relación con el organismos, sin embargo, cuando el objetivo es utilizar un compuesto que no requiere ser activado y se requiere tener la certeza de que el organismo ha recibido una dosis determinada, el método de inyección puede ser utilizado (Ramos, 1994). Aunque la inyección es un método invasivo y es necesario practicar previamente para evitar la pérdida de muchos organismos, ofrece la ventaja de que se utilizan cantidades mínimas de compuesto, por lo que el desecho de residuos peligrosos al ambiente es mínimo.
1.7 Metanosulfonato de Etílo (EMS).
Agente mutagénico alquilante de acción directa en el ADN de plantas y
17 apareamiento con su base nitrogenada correspondiente (Figura 2) (Sega, 1984). Debido a su amplio espectro de acción es usado a escala experimental como un mutágeno, teratógeno y es reconocido como carcinógeno de cerebro en humanos (IARC 1974, HSDB, 2000, Merck 1989).
Figura 2. Acción alquilante del EMS en una base nitrogenada (Tomado de Russell, 1998).
En bacterias provoca mutación puntual por transición GC a AT (Coulondre y Miller, 1977), y es carcinogénico en mamíferos (Williams, 1989). También se han realizado distintos ensayos en insectos, como en Ceratitis capitata el tratamiento con EMS induce genes letales dominantes en la células germinales de los machos (Busch-Petersen et al., 1986), en D. melanogaster se ha evaluando el potencial del EMS para inducir mutantes de color de ojo y genes letales recesivos ligados al cromosoma X (Hsiao Pei et al., 2001) y recientemente en la mosca mexicana de la fruta A. ludens se han logrado inducir mutantes de forma de ala (García et al., 2008), sin embargo, el mecanismo por el cual induce cambios en la estructura de un gen aún no está bien determinado (Meuth y Arrand, 1982), así como el papel de los efectos
18 secundarios de agentes alquilantes (ruptura de cromosomas y el intercambio de cromátidas hermanas) en la mutagénesis (Perry y Evans, 1975).
1.8 Anastrepha ludens Loew (Tephritidae).
La familia Tephritidae se encuentra dentro del orden Díptera y comprende aproximadamente 4,000 especies distribuidas en las zonas templadas, subtropicales y tropicales del mundo. Las larvas de estos insectos se alimentan de diferentes partes de las plantas, sobre todo de frutos (Coronado y Márquez, 1991), algunas especies están consideradas como plagas de gran impacto en la fruticultura (Hernández-Ortiz, 1996). El género Anastrepha comprende cerca de 200 especies distribuidas en el continente Americano (Aluja, 1994).
La mosca mexicana de la fruta (A. ludens Loew) adulta mide cerda de 1.0 cm. Su cutícula es de color pálido, naranja-amarillo, con dos o tres rayas blancuzcas a lo largo del tórax (Figura 3a); la cabeza con las genas y el vértice totalmente amarillo; ojos generalmente verde metálico a rojizos; antenas sin arista desnuda y filamentos pilosos (Figura 3b); las alas son grandes, transparentes y con mancha de color amarillo oscuro en forma de S (banda S) o V (banda V) ligeramente separadas. La banda S completa se une al margen costal, pero pueden estar un poco separadas (López et al., 2010) (Figura 3c). El abdomen consta de cinco segmentos y los terguitos son de color amarillo, en la hembra termina en un tubo ovopositor delgado de tamaño mediano de 3.4 a 4.7 mm de longitud (Figura 4b), presenta de 9 a 10 dientes (López et al., 2010), el cual usa para depositar sus huevos por debajo de la cáscara de la fruta
19 huésped; en el macho la región más apical del abdomen es rombo (Figura 4a) (Fraire y Cárdenas, 2004).
(a) (b) (c)
Figura 3. Aspecto de algunas regiones del cuerpo de A. ludens, (a) vista dorsal del tórax donde se aprecian la quetotaxia; (b) Vista frontal de la región cefálica, se aprecian las antena y las cerdas; (c) Aspecto del ala, mostrando la Banda S y la Banda
V.
(a) (b)
Figura 4. Adultos de A. ludens. (a) Macho; (b) Hembra.
Los huevos de las especies de Anastrepha son cremosos, blancos y elongados, están protegidos por un corion translúcido (Figura 5a). Las larvas presentan un aspecto de gusano, carecen de ojos y de patas, la longitud varía de 3 a 15 mm y su cuerpo está compuesto por la región cefálica y once segmentos, de los cuales tres corresponden a la región cefálica y ocho al abdomen; presenta tres estadios larvarios (Figura 5b). La pupa es una cápsula
20 de forma cilíndrica con once segmentos y el color varía en diversas tonalidades de café, su longitud es de 3 a 10 mm y su diámetro de 1.25 a 3.25 mm. (Figura 5c) (Aluja, 1993).
(b) (c)
(a)
Figura 5. Aspecto de los diferentes estadios de A. ludens. (a) Huevo; (b) Los tres estadios larvarios; (c) Pupa. (Modificado de Zepeda-Cisneros, at. al, 2007).
21 2. JUSTIFICACIÓN.
La construcción del mapa genético de A. ludens es una herramienta primordial para optimizar nuevas alternativas o mejoras a la TIE contra esta plaga, ya que permitiría la construcción de re-arreglos cromosómicos, indispensables para la construcción o la mejora de una CSG que permitiría una mayor efectividad de la TIE, además de que se podría facilitar la identificación de las moscas liberadas mediante el uso de marcadores genéticos. Por lo que es imprescindible crear cepas mutantes y uno de los métodos para lograr esto, es mediante el empleo de compuestos mutagénicos como el EMS. Como el uso de estos compuestos es perjudicial para el ser humano y el ambiente, es prioritario encontrar un método de administración que disminuya el riesgo de uso.
22
3. OBJETIVOS.
General
Inducir mutaciones morfológicas en A. ludens y analizar su potencial para el mejoramiento de la Técnica del Insecto Estéril (TIE).
Particulares
Determinar un rango de concentraciones de EMS que pueda ser utilizado como parámetro para inducir mutaciones en adultos de A. ludens al ser aplicadas mediante micoinyección.
Identificar y aislar posibles marcadores morfológicos
(mutaciones).
Determinar sí el marcador morfológico producido es heredable. Establecer el tipo de herencia de los marcadores morfológicos. Evaluar la viabilidad y la competitividad sexual de las cepas
23
4. MATERIALES Y MÉTODOS.
4.1 Características del mutágeno.
Metanosulfonato de etílo (EMS). CH3SO3CH2CH3 (Figura 6). CAS No. 62-50-0.
Líquido incoloro con un punto de ebullición de 213 a 213.5 oC (761mm Hg)
(Merck 1989). Tiene una densidad de 1.1452 a 22 oC (IARC, 1974). El peso
moléculas del compuesto es de 124.2 u (Sax, 1979). La síntesis de EMS se lleva a cabo por la reacción de metanosulfonato anhídrido con alcohol etílico (Sega, 1984).
Figura 6. Molécula del EMS.
4.2 Obtención y manejo de adultos de A. ludens de la cepa silvestre Chis.
Los adultos con fenotipo silvestre se obtuvieron a partir de frutos infestados de naranja (Citrus aurantium L.), toronja (Citrus paradisi Macfayden) y matasano (Casimiroa sapota Oerst) colectados en el estado de Chiapas. Esta cepa se denominó Chis y se ha mantenido en condiciones de laboratorio por varias
generaciones (70-80 % HR, 26o C y un fotoperiodo de 12:12 [L : O])
(Zepeda-Cisneros et al, 2010). El ciclo de vida de esta cepa bajo estas condiciones es de alrededor de 40 días desde la ovoposición hasta que el adulto llega a la madurez sexual (Figura 7) (Zepeda-Cisneros et al, 2007).
24 Días 14 4 40 0 30 Huevo (4 días)
Madurez sexual (10 días) Pupa (16 días)
Larva (10 días)
Figura 7. Diagrama del ciclo de vida de A. ludens donde los diferentes colores representan los fases del desarrollo; la flecha azul indica el día en que las pupas son
transferidas a las jaulas, dos días antes de que emerjan los imagos.
El proceso de cría consistió en la colecta de los huevos mediante el uso de paneles de silicón, los cuales consisten en un tubo PVC de 9 cm de diámetro por 5 cm de altura, adhiriendo en uno de los extremos una pieza de tela tergal negra siliconizada, los cuales fueron colocados en la parte superior de la jaula permitiendo la penetración del ovopositor de la hembra (Figura 8, a y b). Los huevos colectados fueron colocados sobre tela raso negra y bajo ésta, se colocó papel filtro humedecido hasta sobre-saturación dentro de cajas Petri (Figura 8c)
e incubados a 26o C por cuatro días. Una vez que eclosionaron las larvas
neonatas fueron transferidas a recipientes de plástico (con una perforación en la tapa que es cubierta con una tela tergal para ventilación) que contenía una dieta artificial (a base de polvo de olote) dispuesta en recipientes de plástico; el
desarrollo larval duró diez días a 26o C y 80% H (Figura 8d). El desarrollo de la
pupa comenzó a partir de la recuperación de las larvas de la dieta artificial bajo chorro de agua, utilizando un colador para retenerlas, posteriormente fueron colocadas en contenedores de plástico con vermiculita, la cual sirvió de sustrato
para la pupación a 24-25o C por 14 días (Figura 8e). Transcurrido este tiempo
25 jaulas para su emergencia dos días después. Los adultos alcanzaron la madurez sexual a los diez días de edad (Zepeda-Cisneros et al, 2007).
(a) (b)
(c) (d)
(e) (f)
Figura 8. Dispositivos utilizados durante el proceso de cría de A. ludens. Panel recubierto con silicón (a); jaula de 10 x 10 x 10 cm (b); Cajas petri para incubación (c); Recipiente con dieta a base de polvo de olote (d); Pupas en vermiculita (e); Contenedor
con moscas recién emergidas.
Una vez que emergieron los adultos, se separaron las hembras de los machos y se colocaron en contenedores de plástico de 15 x 15 x 25 cm (Figura 8f) con
26 alimento estándar en proporción 3:1 de azúcar y proteina hidrolizada; y provistas de agua en bebederos.
Todas las cruzas realizadas donde la proporción fue de 2♀: 1♂ se hicieron en jaulas de 10 x 10 x 10 cm (Figura 8b), las cuales fueron provistas de agua y alimento estándar (3:1).
4.3 Microinyección de EMS.
Para la inducción de mutaciones, se preparó una serie de diluciones de EMS a partir de 3ml de una solución inicial a 9 mM preparada con agua destilada, las concentraciones evaluadas fueron: 9, 4.5, 2.25, 1.12, 0.56, 0.28, 0.14, 0.07, 0.03 y 0.01 mM, más dos testigos negativos, uno inyectado solamente con agua destilada y el otro sin inyección. Para la inyección se utilizó una micro jeringa hecha a partir de una pipeta Pasteur modificada con la flama de una lámpara de alcohol (Figura 9a) (Figura 9b).Se tomaron 25 machos con 24 horas de
emergidos al azar, se anestesiaron con éter y se inyectaron con ≈50 µl en la
cavidad abdominal con las distintas concentraciones de EMS. Realizando todo el procedimiento por duplicado. Se cuantificó el número de moscas sobrevivientes a las 216 hrs. post-tratamiento.
Para determinar el efecto del EMS en los machos inyectados se obtuvo un Índice de sobrevivencia (IS) de acuerdo con el método propuesto por Arellano (2002). Se calculó el IS para cada lote experimental incluyendo los testigos y las repeticiones correspondientes. Posteriormente fueron promediados los IS
27 obtenidos por concentración y se obtuvo un IS promedio y el error estándar de la distribución muestral de las medias de el IS.
Para calcular el IS, se aplicó la siguiente fórmula:
IS = Σ organismos del lote experimental / Σ organismos del lote testigo (Arellano, 2002)
(a) (b)
Figura 9. Micro jeringa obtenida a partir de una pipeta Pasteur (a); Microinyección realizada a un macho de A. ludens (b).
4.4 Obtención de la F1.
Los machos de 10 días de edad que sobrevivieron al tratamiento con EMS fueron cruzados con hembras vírgenes no tratadas de la misma edad, en una proporción de dos hembras por macho (2:1). En promedio se clocaron tres machos y seis hembras en cada jaula por concentración. Una vez que las moscas copularon se realizaron tres colectas de huevos en lapsos de 24 horas. Los huevos colectados fueron incubados y se realizó el proceso de cría previamente descrito. Una vez emergidos los adultos fueron cuantificados y se
mantuvieron en jaulas de 15 x 15 x 25 cm. En esta generación (F1) se
mantuvieron tres jaulas por cada una de las colectas de huevos, teniendo un total de nueve jaulas por concentración.
28
Una vez que emergieron los adultos de la F1, fueron anestesiados con éter,
contabilizados y se revisó su morfología en busca de alteraciones fenotípicas mediante el uso de un un microscopio estereoscópico Stemi SV6 y una lámpara de luz fría KL 1500 (Carl Zeiss, Jena, Alemania).
Al obtener la F1 se estimó el número de progenie por macho como un indicador
de actividad genotóxica transgeneracional por efecto del EMS. La progenie por macho fue calculada a partir de un cociente que se obtuvo dividiendo el total de
organismos de la F1 entre el número de machos (tratados) que originó esta F1.
Esto se hizo para la serie experimental, el testigo y para las repeticiones correspondientes, para posteriormente promediar y obtener la progenie estimada por macho promedio y el error estándar de la distribución muestral de las medias.
4.5 Obtención de la F2.
Para la obtención de la F2 se eligió al azar una jaula de cada una de las colectas
de huevos realizadas para cada concentración que dio origen a la F1, de tal
manera que se tuvieran tres jaulas de 15 x 15 x 25 cm, por concentración para la
F2. Se realizó una colecta de huevos de cada jaula seleccionada y se llevó a
cabo el proceso de cría antes descrito. Una vez emergidos los adultos fueron
cuantificados al igual que la F1. Los organismos fueron observados utilizando un
microscopio estereoscópico para identificar las alteraciones morfológicas de posibles mutantes, los cuales fueron separados en otras jaulas para darles seguimiento.
29
4.6 Manejo de los organismos mutantes.
Las moscas de la F2 con fenotipos alterados fueron aisladas y colocadas en
jaulas de 10 x 10 x 10 cm, provistas de alimento y agua. Para obtener líneas puras de los mutantes se hicieron cruzas de hembras y machos mutantes en proporción de dos hembras por macho (2:1); si la mutación se encontraba en los machos, las cruzas se hicieron con hembras vírgenes en proporción de cuatro
hembras por macho (4:1) obteniendo una F1, de la cual se cruzaron las moscas
entre sí (2:1) para obtener la F2.
Las moscas de esta F2 que expresaban el marcador genético (morfológico)
fueron cruzadas entre sí como una prueba de homocigocidad para obtener una línea pura.
4.7 Determinación del patrón de herencia de los mutantes.
Para caracterizar el patrón de herencia de los mutantes encontrados, se colocaron en jaulas hembras silvestres vírgenes y machos mutantes de 24 h de edad en una proporción de (2♀:1♂) y también se hizo la cruza recíproca
(alternando los sexos). Una parte de las hembras y machos obtenidos de la F1
se colocaron en jaulas, en la misma proporción (2:1) para aparearse y obtener la
F2. Las moscas recuperadas fueron cuantificadas y clasificadas por fenotipo y
sexo. El procedimiento se repitió al menos cuatro veces. La otra parte de
moscas de la F1 fueron aisladas por sexos para realizar las cruzas de prueba.
A través de las cruzas de prueba se corroboró que el patrón de herencia es: homócigoto recesivo (alelos recesivos que sólo se expresarán cuando se
30 encuentran en homocigosis), homócigoto dominante (siempre se expresa la mutación), heterocigoto (sí expresa la mutación indica que se trata de un alelo dominante y sí no manifiesta la mutación se trata de un alelo recesivo) o alguna otra interacción génica, así como el número de genes involucrados se realizaron las cruzas de prueba ♀♀ mutantes X ♂♂ heterocigotos y su cruza recíproca, ♂♂
mutantes X ♀♀ heterocigotas en las que se compararon los resultados de las
diferentes cruzas y se determinaron si había o no concordancia con los genotipos propuestos para los organismos mutantes. Para clasificar los fenotipos y el sexo de las moscas recobradas de estas cruzas se utilizó un microscopio estereoscópico Stemi SV6 y una lámpara de luz fría KL 1500 (Carl Zeiss, Jena, Alemania).
4.8 Viabilidad y atributos biológicos de las cepas mutantes.
Para determinar los parámetros de viabilidad y atributos biológicos de los mutantes encontrados, se colocaron 10 moscas sexualmente maduras en proporción (1♀: 1♂) por cada cepa y se compararon con la cepa Chis. Se usaron jaulas de 10 x 10 x 10 cm, provistas de agua y alimento. Cada jaula fue considerada una repetición y por cada cepa se realizaron 6 repeticiones. Después del apareamiento, se hicieron las colectas de huevos por jaula cada 24 horas, actividad que se repitió seis veces, siguiendo el proceso de cría referido anteriormente y contabilizando el número de organismos para cada fase del desarrollo postembrionario. Los atributos biológicos evaluados fueron la fertilidad (considerando la eclosión máxima); la transformación huevo-larva, larva-pupa, pupa-adulto, huevo-adulto y por último se obtuvo un overall fitness.
31 Para determinar la viabilidad, se obtuvo un cociente para cada estado inmaduro dividiendo el total de organismos de cada fase del desarrollo entre el número de huevos contabilizados para cada cepa; esto se hizo para cada repetición correspondiente, para posteriormente promediar las viabilidades de cada repetición (por cepa) y obtener una viabilidad promedio y el error estándar de la distribución muestral de las medias.
La fertilidad se estimó considerando el total de larvas eclosionadas después de 7 días entre el total de huevos observados. La transformación huevo-larva se obtuvo dividiendo el número de larvas de tercer estadio entre el total de huevos. La transformación larva-pupa, se calculó mediante el total de pupas y se dividió entre el total de larvas contabilizadas. Para la transformación pupa-adulto se obtuvo el cociente del número total de pupa-adultos con respecto al número de pupas. Lo anterior se hizo para cada cepa. Por último se estimó un fitness total por cada cepa multiplicando la fertilidad por cada uno de los
valores de la transformación de los estados inmaduros. Para cada una de las variables se obtuvo un valor promedio y el error estándar de la distribución muestral de medias.
4.9 Competitividad sexual de machos de las cepas mutantes.
Para verificar la preferencia de apareamiento de la hembra Chis con respecto a las cepas mutantes, de cada una de estas y de la cepa Chis se seleccionaron 100 adultos al azar recién emergidos; separándolos por sexos y manteniéndolos en jaulas separadas provistas con agua y alimento. Cuando alcanzaron la madurez sexual (diez días después de emergidas), las moscas
32
fueron anestesiadas con CO2 para después ser transferidas a jaulas de 30 x 30
x 30 cm. En cada jaula se colocaron 25 ♀♀ silvestres, 25 ♂♂ silvestres y 25
♂♂ mutantes y se evaluó la preferencia de las hembras en cuanto al tipo de macho en un lapso de cinco horas empezando a las 14:00h y terminando a las 19:00h. El procedimiento se hizo por duplicado.
Una vez que iniciaron las cópulas, cada pareja fue retirada de la jaula y colocada en cajas de Petri, registrando la hora de inicio y de fin de la cópula, así como el tipo de macho con el que copuló la hembra. Para la identificación de los machos, una vez que finalizó la cópula, se revisaron las cajas de Petri utilizando un microscopio estereoscópico Stemi SV6 y una lámpara de luz fría KL 1500 (Carl Zeiss, Jena, Alemania). Además, se llevó un registro de la temperatura y de la humedad.
Se obtuvo el Índice de esterilidad (RSI por sus siglas en inglés), que en este caso se utilizó para evaluar la elección (del macho) de la hembra silvestre. Se obtuvo un RSI para cada repetición por cepa y un RSI promedio y el error estándar de la distribución muestral de medias.
El RSI se calculó de la siguiente manera: MS MS + SS RSI=
(Cayol et al., 1999)
Donde:
MS = Número de cópulas ♂ mutante / ♀ silvestre SS = Número de cópulas ♂ silvestre / ♀ silvestre
33 El índice de esterilidad (RSI) fue utilizado para evaluar la preferencia de la hembra silvestre en el apareamiento con los machos de las diferentes cepas. El valor del RSI oscila entre 0 y 1 a un valor de equilibrio de 0.5, representó una conducta de apareamiento en igualdad para los machos silvestres y mutantes. Valores de RSI menores a 0.5 indican que los machos mutantes presentan una menor competitividad que los machos silvestres y valores de RSI mayores a 0.5 representan una mayor competitividad que los machos silvestres.
4. 10 Análisis de datos.
Para corroborar si hubo o no diferencias significativas en el IS, se aplicó un
análisis de varianza (ANOVA) de una vía con una α= 0.05 (verificando
previamente el cumplimiento de los supuestos para el análisis) mediante el programa Minitab 15.
Para verificar si existían diferencias significativas en la progenie por macho, se
utilizó una ANOVA con un α = 0.05 (Minitab 15). También se evaluó si en la
descendencia obtenida algún sexo en particular presentaba algún efecto por el tratamiento (PSx). Se comparó la proporción de hembras recuperadas con el total de las moscas en cada concentración. Esto se determinó como total de hembras / total moscas por concentración.
Para confirmar el tipo de herencia de los mutantes se compararon las frecuencias de los fenotipos observados en las diferentes cruzas con las frecuencias esperadas según el tipo de herencia propuesta con base en el
34 resultado de las cruzas realizadas. Para estimar que la probabilidad entre los valores observados y esperados no se debiera al azar se utilizó la prueba de
bondad de ajuste, Chi cuadrada (χ2) con α = 0.05, mediante el programa de
Office, Microsoft Excel 2007.
Para determinar si había diferencias fueron significativas entre los promedios calculados de la viabilidad y de la transformación de cada cepa mutante con respecto al testigo los datos fueron sometidos a una prueba de t-Student, con una α = 0.05, para hacer el análisis se utilizó el programa Minitab 15.
Los RSI promedios fueron comparados mediante una t- Student con un α =
35 El siguiente diagrama muestra el método seguido en el tratamiento con EMS en A. ludens.
Mantenimiento de la cepa Chis
Obtención, sexado y separación de los imagos en jaulas diferentes
Machos Hembras Cruza (2?:1 ?) Tratamiento Experimental Microinyección Obtención y manejo de la F2 Periodo de recuperación de 9 días
Prueba de competitividad sexual
Obtención y manejo de de la F1 (huevos, larvas, pupas y adultos) Elaboración de las diluciones sucesivas
de 9 – 0.0175 mM Preparar las solución stock 9 mM
Preparación de las jaulas
individuales (10 x 10 x10
cm) Alimento y bebederos
Aislamiento posibles mutantes Elaboración de las micro jeringas
Revisión morfológica y cuantificación de organismos
Mutantes Determinación de la herencia
Determinación de la viabilidad de cada cepa IS cada 24 h.
24 h. edad
3 jaulas por [ mM ]
3 colectas de huevo por jaula 11 jaulas
3 jaulas por [mM] 3 colectas
36
5. RESULTADOS.
5.1 Curva de dosis respuesta.
Para determinar el efecto tóxico del tratamiento con EMS, se estimó el Índice de sobrevivencia promedio para los machos sobrevivientes a los 10 días de edad post-tratamiento. Los valores obtenidos para la curva de sobrevivencia de los machos inyectados (promedio IS ± error estándar) se muestran en el cuadro 1.
Cuadro 1. Índice de sobrevivencia de machos recobrados después de ser inyectados con EMS comparados con dos testigos (uno sin inyección y otro con inyección de agua destilada)
(promedio ± error estándar).
[ mM ]
Testigo c/inyección H2O
dest. Testigo sin inyección
% sob.
IS prom. ±
error est. % sob.
IS prom. ± error est. Testigo 42 1.00 ± 0.00 73 1. 00 ± 0.00 0.01 41 1.01 ± 0.23 41 0.56 ± 0.07 0.03 49 1.15 ± 0.26 49 0.67 ± 0.21 0.07 54 1.30 ± 0.03 54 0.74 ± 0.09 0.14 38 0.93 ± 0.15 38 0.53 ± 0.03 0.28 51 1.23 ± 0.04 51 0.70 ± 0.05 0.56 48 1.16 ± 0.10 48 0.66 ± 0.01 1.12 49 1.15 ± 0.22 49 0.67 ± 0.19 2.25 51 1.22 ± 0.13 51 0.70 ± 0.14 4.5 45 1.14 ± 0.35 45 0.63 ± 0.14 9 19 0.48 ± 0.19 19 0.26 ± 0.08
% sob.- Porcentaje de moscas sobrevivientes a las 216 hrs. n= 50
Los organismos recobrados en las diferentes concentraciones expresaron un efecto diferente en la sobrevivencia al compararlos con los dos testigos (Figura 10), pues el promedio de machos sobrevivientes se incrementó con respecto al testigo de agua inyectada, mientras que al compararlos con el testigo sin inyección la sobrevivencia fue menor. El efecto de estrés provocado por la técnica de inyección fue mínimo sí observamos el porcentaje de sobrevivientes
37 del testigo con respecto a los experimentales, con excepción de la última concentración. 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 0.001 0.01 0.1 1 10 Ín d ic e d e s o b re v iv e n ci a [mM]
Testigo con inyección Testigo sin inyección
Ín d ic e d e S o b re v iv e n ci a p ro m e d io
Figura 10. Índice de sobrevivencia promedio de los machos sobrevivientes con 10 días de edad, las líneas verticales indican el error estándar (±).
De acuerdo con el análisis de varianza no se observó diferencias significativas:
1) testigo inyectado con el vehículo (F = 1.47; gl = 10, 11; P ˃ 0.05); 2) testigo
no inyectado (F = 2.37; gl= 10, 11; P ˃ 0.05).
5.2 Progenie por macho.
En el cuadro 2 se presenta el promedio de progenie estimada por macho de acuerdo a la concentración del tratamiento junto con el error estándar. El tratamiento con EMS en los machos está provocando una diferencia en la fertilidad y en la cantidad de progenie (fecundidad).
38
Cuadro 2. Resultados de la progenie estimada promedio (Prog. Est. Prom ± error estándar) de los machos tratados x hembras vírgenes no tratadas y proporción sexual promedio (PSx prom.
± error estándar) de la progenie encontrada
[ mM ] ♂ trat n Prog. Est. Prom. ± E.
E. PSx prom. ± E.E. Tsi 17 2082 118.64 ± 1.75 0.50 ± 0.017 TD 17 1731 105.53 ± 24.75 0.48 ± 0.007 0.01 19 2421 140.85 ± 29.93 0.49 ± 0.005 0.03 21 2925 135.67 ± 25.33 0.50 ± 0.023 0.07 21 3517 169.58 ± 80.44 0.50 ± 0.011 0.14 15 1989 139.83 ± 36.16 0.48 ± 0.021 0.28 19 2587 141.03 ± 25.63 0.48 ± 0.006 0.56 18 2047 124.36 ± 32.30 0.48 ± 0.005 1.12 19 1284 60.87 ± 11.04 0.48 ± 0.049 2.25 23 3204 136.49 ± 88.01 0.49 ± 0.002 4.5 22 2482 108.16 ± 7.10 0.49 ± 0.014 9 8 557 70.25 ± 1.25 0.49 ± 0.038
Tsi- Testigo sin inyección; TD- Testigo inyectado con agua destilada; ♂ trat - machos tratados
con EMS, agua destilada; [mM]; n: total de progenie.
El efecto del EMS sobre la fecundidad de los machos fue similar entre las concentraciones, aunque en las concentraciones 1.12 y 9 mM la progenie recuperada muestra una disminución, mientras que en las concentraciones 0.07, 0.28 y 2.25 mM hay un incremento en los organismos recuperados en comparación con los testigos (Figura 11), no obstante, de acuerdo con el análisis de varianza, las diferencias registradas entre los promedios de las
progenies obtenidas no fueron significativas (F = 0.59; gl = 11, 12; P ˃ 0.05).
Estas concentraciones mencionadas coinciden con los puntos de máxima sobrevivencia registrada en los machos tratados con EMS (cuadro 1).
En el cuadro 2, se muestra que la proporción de sexos de las moscas no fue afectada por el tratamiento, ya que no se aprecian cambios significativos en la proporción de sexos esperados para cada sexo con respecto a los testigos.
39 0 50 100 150 200 250 300 Tsi TD 0.01 0.03 0.07 0.14 0.28 0.56 1.12 2.25 4.5 9 N ú m e ro d e p ro g e n ie [ mM ]
Figura 11. Progenie por macho promedio de los machos expuestos a EMS. Las líneas verticales indican el Error estándar. Testigo sin inyección (Tsi), Testigo con inyección del
vehículo (TD).
En la figura 11 y el cuadro 2 se puede observar una tendencia variable. Donde debe considerarse que el promedio de progenie por macho no refleja necesariamente la cantidad de descendencia que tienen todos los machos, pues existen algunos machos que pueden ser estériles así como otros, que producen una gran cantidad de progenie con respecto al promedio general, sin embargo, los errores estándar nos pueden indicar qué tanta variación existe dentro de cada lote con respecto a la progenie promedio, es decir, mientras más grande sea la variación menos homogéneo es el número de progenie por cada macho.
40
5.3 Descripción de los mutantes obtenidos.
En las concentraciones 0.2812 y 4.5 mM, se encontraron organismos con fenotipo mutante.
5.3.1 Mutación red body (rb).
Este marcador morfológico fue encontrado en un macho que presentaba un cambio en la coloración del cuerpo en comparación con el fenotipo silvestre
(Figura 12). Se obtuvo de laF2 de la línea tratada con la concentración de 4.5
mM.de EMS. Este macho se cruzó con cuatro hembras silvestres (vírgenes) en una jaula individual (10 x 10 x 10 cm), obteniendo hembras y machos con
fenotipo silvestre, los cuales fueron cruzados entre sí para obtener una F2 donde
apareció nuevamente el marcador genético. Las moscas de esta F2 que
presentaban el marcador morfológico fueron cruzados entre sí y se obtuvo una descendencia completamente red body, sugiriendo que este marcador se expresa en homocigosis.
El fenotipo rb se caracteriza por tener la cabeza con las genas, frente y el vértice rojizo. No mostró alteraciones en las cerdas postocelares, orbitales y frontales (Figura 13). El escuto torácico rojizo con una franja delgada amarilla rojiza que se ensancha hacia la parte posterior y dos franjas amarillas rojizas a los lados de esta, que van de la sutura transversal hasta poco antes de llegar al escutelo, con una mancha oscura en la sutura escuto-escutelar a veces difusa, el escutelo es de color más claro, las macro cerdas de tórax son de color castaño obscuras o negras sin alteración (Figura 14). El abdomen presenta los terguitos rojizos en el macho (Figura 15a) y en la hembra solamente el último
41 segmento tergal (funda del ovipositor) y el resto de los segmentos son de color claro (Figura 15b).
Figura 12. Fenotipo red body (rb) (izquierda) (primer organismos encontrado, la apariencia de las alas corrugadas no forman parte de la mutación) y Fenotipo silvestre
(rb+) (derecha).
Figura 13. Aspecto de la cabeza del mutante red body (rb).
Figura 14. Apariencia del Tórax de una mosca silvestre (izquierda) y de una mosca red body (rb) (derecha). Las cerdas con apariencia normal.
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(a) (b)
Figura 15. Macho (a) y hembra (b) de red body (rb).
Determinación de la herencia y el número de cromosomas involucrados.
De la cruza realizada entre moscas de fenotipo silvestre (rb+/rb+) y moscas tipo
red body (rb/rb) (y la cruza reciproca), se obtuvieron organismos con el fenotipo
silvestre (Figura 16). ♀ ♀ rb+ / rb+ ♂ ♂ rb / rb X P gametos rb+ rb+ rb rb F1 rb+/ rb rb+/ rb rb+/ rb rb+/ rb ♀ ♀ rb / rb ♂ ♂ rb+/ rb+ X P gametos rb rb rb+ rb+ F1 rb+/ rb rb+/ rb rb+/ rb rb+/ rb
Figura 16. Resultado de cruzas de progenitores entre silvestre (rb+/rb+) y red body (rb/rb), con la cruza reciproca. Las moscas de la F1 son heterocigotas para la mutación
y tienen fenotipo silvestre.
Dado que en la descendencia de la cruza de progenitores no expreso el fenotipo mutante y mostró un fenotipo similar al silvestre, se infirió que el
genotipo de las moscas es heterocigoto (rb+ / rb). Para confirmar esta hipótesis,
