Composición de la zona pelúcida del wallaby de Bennett

Hemos demostramos la presencia de 6 transcritos (ZP1, ZP2, ZP3-a, ZP3-b, ZP3-c y ZP4) en el ovario del wallaby de Bennett. Obtuvimos el ADNc completo de ZP1, ZP2, ZP3-a, ZP3-b y ZP4 y un fragmento casi completo del marco abierto de lectura de ZP3-c.

6.1.1.1.1 Dominios proteicos

El análisis de las secuencias de ZP1 y ZP4 indica que son secuencias codificantes, presentando un marco abierto de lectura, con un codón de iniciación y un codón de terminación. La comparación de las secuencias obtenidas, con las secuencias de otros mamíferos disponibles en el GenBank indica una alta homología con ZP1 y ZP4 de las otras especies (Ver fig. 22 y 23 de Resultados) mostrando una estructura similar a la de otras proteínas de la

ZP que presentan dominios conservados a lo largo de las especies. Así, presentan, un péptido señal, un dominio trefoil, un dominio ZP y un dominio transmembrana.

El dominio ZP es esencial para la formación de la estructura filamentosa de la ZP. La distribución de los residuos cisteína en este dominio, se encuentra altamente conservada entre los mamíferos euterios y metaterios. Observamos que los 10 residuos cisteína presentes en el dominio ZP de ZP1 y ZP4 del wallaby de Bennett están conservados en todas las especies comparadas; la mujer, coneja, ratona, rata y zarigüeya. Aunque esto suponga una evidencia de la similitud de la estructura primaria entre las proteínas de diferentes especies; se ha visto que los puentes disulfuro que unen estas cisteínas no son idénticos entre especies por lo que no implica homología en la estructura terciaria, como ha sido descrito previamente en la cerda (Kanai et al., 2008).

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En marsupiales, algunos autores opinan que, el grado de enlaces disulfuro en la ZP puede diferir de la de los mamíferos euterios; puesto que, hay una susceptibilidad baja de la ZP de marsupiales a la reducción mediante β-mercaptoetanol y ditiotreitol (Chapman et al., 2000a).

6.1.1.1.2 Glicosilación

Se ha descrito una alta homología entre las glicoproteínas de la ZP en diferentes especies; pero se han observado diferencias evidentes en cuanto a la glicosilación que podrían estar relacionadas con la especificidad en la interacción entre los espermatozoides y la ZP (Wassarman, 1988; McCartney y Mate, 1999; Chapman et al., 2000b; Chakravarty et al., 2008).

Estudios realizados con lectinas en diversos marsupiales ponen de manifiesto la presencia de N-oligosacáridos en su ZP (Chapman et al., 2000b).

Estos estudios concuerdan con los realizados previamente en la zarigüeya australiana; donde las secuencias de ZP2, ZP3-a y ZP4 han sido amplificadas, destacándose la presencia de 9 sitios potenciales de N- glicolsilación en ZP2 (de los cuales 1 es débil), 2 en ZP3-a y 5 en ZP4 (de los cuales 3 son débiles). Los autores señalan que aunque algunos de los sitios potenciales de glicosilación se encuentran conservados, hay variación en el número y posición de los mismos (Mate y McCartney, 1998; Voyle et al., 1999; McCartney y Mate, 1999; Haines et al., 1999; Breed, 2002). Coincidimos con estos

autores en que en la glicoproteína ZP4 del wallaby de Bennett, se observa una mayor heterogeneidad respecto a la potencial glicosilación al compararla con la de otras especies. Sin embargo, debemos tener en cuenta que ZP1 nunca había sido secuenciada en marsupiales y según nuestros análisis comparativos observamos que en el wallaby de Bennett, esta glicoproteína presenta un mayor grado de conservación en la glicosilación que la glicoproteína ZP4.

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ZP1:

En ZP1, Asn67 y Asn332 están conservados en todas las especies comparadas: mujer, coneja, ratona, rata y wallaby de Bennett. Además, la proteína ZP1 madura de wallaby presenta un sitio putativo de N- glicosilación no presente en las otras especies (Asn246). Por otro lado, el sitio de glicosilación Asn49 descrito en la región N-terminal de ZP1 de ratón y rata no está conservado en el wallaby (Boja et al., 2003, 2005, Stetson et al., 2012).

En resumen, en ZP1 del wallaby de Bennett encontramos 3 sitios potenciales de N-glicosilación; mientras que en las especies comparadas encontramos: 2 en la coneja y la mujer, 3 en la rata y 4 en la ratona (Boja et al., 2003, 2005; Stetson et al., 2012). El hecho de que estos sitios se hayan

conservado en la evolución de los mamíferos implicaría su potencial importancia en la funcionalidad de la proteína.

ZP4:

En ZP4, hay dos sitios putativos de N-glicosilación conservados en todas las especies comparadas: mujer, coneja, rata, zarigüeya y wallaby de Bennett; Asn66 y Asn471. Además, el sitio putativo de N-glicosilación Asn199 está presente en todas las especies excepto en la rata. En posición Asn264, hay un sitio putativo de N-glicosilación presente en los dos marsupiales estudiados y en la mujer. Asn323 está presente en la rata y el wallaby, faltando en la zarigüeya. El sitio Asn402 sólo está presente en los marsupiales y sitio el de N-glicosilación Asn475 está presente en los marsupiales y en la coneja. En la ZP4 de rata, han sido descritos 4 sitios de N-glicosilación, en posiciones Asn50, Asn74, Asn228 and Asn336 (Hoodbhoy et al., 2005) y dos de ellos (Asn74 y Asn336) están presentes en el wallaby como

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En la mujer se observan 5 sitios potenciales de N-glicosilación, al igual que en el wallaby de Bennett; coincidiendo con los resultados de Haines et al., 1999 realizados en la zarigüeya australiana. Observamos que la glicoproteína ZP4 presenta una mayor variabilidad en relación a la N- glicosilación, estos sitios podrían intervenir en la especificidad de la unión espermatozoide-ZP, mediada en parte por las cadenas de oligosacáridos

(Wassarman, 1988; McCartney y Mate, 1999; Chapman et al., 2000b; Chakravarty et al., 2008).

6.1.2 Pseudogenización de ZP4

Mientras que la pseudogenización de algunos de los genes de la ZP, como ZP1, ZPAX y/o ZPD es un fenómeno que se ha descrito en diversas especies (Goudet et al., 2008); la pseudogenización de ZP4, hasta el momento

únicamente había sido descrita en una especie, el ratón común (Mus musculus) (Lefièvre et al., 2004;Evsikov et al., 2006; Goudet et al., 2008).

Nuestro análisis in silico realizado a partir del genoma disponible para distintos marsupiales indica que los marsupiales presentan un número diferente de glicoproteínas en su ZP según la especie. Además, no sólo no presentan un modelo constituido por ZP2, ZP3 y ZP4, sino que aquella glicoproteína que puede estar sujeta a pseudogenización sería ZP4 y no ZP1. En esta Tesis Doctoral, investigamos si la pseudogenización de ZP4 está relacionada con diferentes órdenes taxonómicos.

El hallazgo de la pseudogenización de ZP4 en el genoma de la zarigüeya de cola corta (Monodelphis domestica), nos llevó a estudiar la presencia de dicho gen en diferentes especies de marsupiales australianos y sudamericanos.

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En este estudio identificamos a ZP4 como un pseudogén en otra especie, la zarigüeya común (Didelphis marsupialis) perteneciente al orden Didelphimorphia. Esta pseudogenización consistía en la ausencia de un codón de iniciación (ATG) y en la presencia de varios codones de stop a lo largo de su secuencia (Ver fig. 32 de Resultados).

Mientras que, en el resto de marsupiales estudiados, todos ellos australianos, el koala (Phascolarctos cinereus), el demonio de Tasmania (Sarcophilus harrisii), el wallaby de Bennett (Macropus rufogriseus) y el wallaby de Tammar (Macropus eugenii); así como en la zarigüeya australiana (Trichosurus vulpecula), donde ZP4 había sido descrita previamente (Haines et al., 1999; Mate et al., 2003) no encontramos indicios de

pseudogenización. Estos resultados sugieren que ZP4 se perdió en el orden sudamericano Didelphimorphia, por tanto los marsupiales pertenecientes a este orden presentan ZP4 pseudogenizada, al igual que el ratón común.

Esto indica que la pseudogenización de ZP4 se produjo tras la separación de los marsupiales australianos y sudamericanos aproximadamente hace unos 80 Ma afectando al orden Didelphimorphia antes de la divergencia de las especies recientes datada hace unos 40 Ma

(Beck, 2008; Meredith et al., 2008; Mitchell et al., 2014). La cuestión permanece

abierta para los órdenes Paucituberculata y Microbiotheria para los cuales no hemos podido conseguir muestras para su análisis.