A lo largo de este trabajo de tesis abordamos distintas estrategias experimentales con el fin de generar modelos murinos que nos permitan entender los eventos tempranos inflamatorios durante una injuria a nivel del intestino delgado y cómo estos eventos podrían conducir a una enteropatía crónica, como la que se observa en EC.
Para comenzar, realizamos un trabajo de puesta a punto del método de inyección de los inductores en la luz del intestino delgado, generando un protocolo que nos permitió la administración directa de los inductores intraluminalmente sin la degradación enzimática propia de la vía oral y minimizando los efectos de un procedimiento microquirúrgico.
Nuestro primer modelo de inducción de enteropatía fue llevado a cabo por la inyección intraluminal de poly (I:C). Contrastamos este modelo con otros preexistentes que utilizaban una vía sistémica de inducción y caracterizamos a nivel de mediadores inflamatorios y celulares el daño generado en la mucosa de estos animales. Encontramos que el eje CXCL10/CXCR3 participa en la inducción de enteropatía, junto con los IFNs tipo I y TNFα, y que las poblaciones celulares de monocito/macrófagos y células dendríticas tienen un rol importante en la generación y severidad del daño.
Planteamos además el estudio de los mecanismos de muerte celular en el intestino delgado encontrando que, probablemente otras vías de muerte distintas a la apoptosis, estén participando en el daño intestinal.
El segundo modelo desarrollado consistió en la inyección intraluminal del péptido derivado de α-gliadina, p31-43. Si bien este péptido ha sido estudiado en diferentes ensayos in vitro, no se había evaluado en un modelo in vivo. Encontramos que el p31-43 genera enteropatía en ratones C57BL/6 y que el daño es específico de la composición particular de aminoácidos, mas no de su secuencia. Observamos que este péptido induce un estado hiperproliferativo en las criptas y muerte celular en lamina propria y epitelio por apoptosis. El daño histológico y la muerte celular fueron dependientes de MyD88. Demostramos que el eje CXCL10/CXCR3 estuvo implicado y se indujo la expresión de citoquinas proinflamatorias como IFNγ e IFNβ. Este modelo se diferenció del anterior en el tipo de daño y en los mecanismos que se activaron como consecuencia.
Conclusiones Finales y Perspectivas
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Nuestro tercer modelo consistió en la combinación de un estímulo de origen dietario (p31-43) con un estímulo de origen viral (poly (I:C)), inyectados intraluminalmente en intestino delgado de ratones C57BL/6. Encontramos que el estímulo combinado también es capaz de producir enteropatía, con similitudes y diferencias respecto a lo que se observó en los estímulos individuales. Esta combinación genera un perfil inflamatorio particular, con incrementos en citoquinas proinflamatorias tales como IFNβ y TNFα, como así también con la inducción del eje CXCR3/CXCL10. A diferencia de los estímulos individuales, el estímulo doble generó un incremento en IL-6 e IL-18, como así también las quimoquinas CXCL2 y MCP1. Por lo tanto, en cuanto al perfil inflamatorio se puede concluir que el estimulo doble generó una respuesta más intensa que los estímulos individuales.
Por otra parte, la combinación de poly (I:C)+p31-43 generó un marcado incremento en la muerte celular, caracterizada por la activación de Caspasa 3 en una gran proporción de células de la lamina propria de los animales tratados, situación que no se había observado antes en los estímulos individuales. Por lo tanto, concluimos que la combinación de poly (I:C)+p31-43 conduce a un daño más severo caracterizado por la participación de vías distintas a las observadas con poly (I:C) o p31-43.
Por otra parte, generamos un cuarto modelo de enteropatía que consistió en un estímulo temprano con poly (I:C) intraluminal, seguido de un desafío oral con gliadinas durante 2 semanas en ratones NOD-DQ8. Estos animales desarrollaron enteropatía aguda con inducción de citoquinas proinflamatorias e inducción de los receptores de poly (I:C). También presentaron una enteropatía a largo plazo que fue más severa cuando la dieta contenía gliadinas. A las 2 semanas, los animales presentaron un perfil proinflamatorio evidenciado a nivel sistémico, como así también una alteración de la función de barrera intestinal con un claro aumento de la permeabilidad.
Nuestro quinto modelo de enteropatía se elaboró en el contexto de ratones NOD-DQ8, pero esta vez se realizó un estímulo intraluminal con p31-43 seguido de una alimentación con gliadinas durante 2 semanas. Estos animales presentaron tempranamente hiperproliferación en criptas e incremento en el número de LIEs, junto con la inducción de citoquinas proinflamatorias, pero sin aparente producción de daño en el tejido. Sin embargo, a las 2 semanas estos animales presentaron enteropatía, la cual fue claramente más severa cuando los animales habían consumido gliadinas. La enteropatía estuvo asociada con una
Conclusiones y Perspectivas Finales
alteración de la función de barrera, particularmente por un trastorno en el transporte paracelular.
Estos dos últimos modelos tienen la utilidad de permitir la evaluación de diferentes inductores innatos o péptidos derivados de gliadina en la patología asociada a gluten, en un contexto genético asociado a EC. Sería de utilidad evaluar la respuesta específica a gliadinas luego de la inducción con estas moléculas, como así también el desarrollo de la enteropatía a tiempos más largos de desafío.
En conclusión, nuestros resultados dan soporte experimental a la hipótesis que ubica a los IFNs tipo I como inductores importantes para la pérdida de tolerancia a antígenos dietarios tales como gluten después de una infección viral, como pudo ser demostrado con poly (I:C) en el modelo de NOD-DQ8. Por otra parte, nuestros resultados con p31-43 dan a este péptido un rol protagónico en el disparo de una respuesta inflamatoria intestinal dependiente de MyD88 y en la inducción de sensibilidad al gluten a largo plazo, con lo cual proponemos un estudio exhaustivo de este péptido en estos modelos in vivo, de modo de caracterizarlo como posible factor de inducción temprano del desencadenamiento, como así también del mantenimiento de la enteropatía observada en paciente celíacos con la enfermedad activa.
Destacamos entonces que, por primera vez, se demuestra la inducción de enteropatía por la presencia de poly I:C o p31-43 en el lumen de intestino delgado en un modelo experimental. De especial relevancia en el conocimiento de los mecanismos tempranos de la patogenia de EC, mostramos que la inducción de enteropatía por poly I:C o p31-43 predispone a una respuesta exacerbada frente a gliadinas de la dieta.
Este modelo experimental reproduce probablemente la situación in vivo en el curso del desarrollo de la enteropatía en EC, donde factores adicionales a la genética y la ingesta de gluten son necesarios para el desencadenamiento de la patología.
El modelo desarrollado permitirá realizar estudios sobre los mecanismos y mediadores (hoy desconocidos) involucrados en las etapas tempranas de EC y permitirá evaluar si los cambios tempranos en la mucosa intestinal condicionan el desarrollo de otras condiciones patológicas en sitios extraintestinales. A su vez, constituye un excelente modelo para generar conocimiento sobre los mecanismos que determinan la Sensibilidad al gluten no celíaca.