Una vez establecido que la administración intraluminal de p31-43 produce daño en la mucosa intestinal, decidimos estudiar los mediadores inducidos por este péptido.
En primer lugar analizamos la expresión del receptor CXCR3 y sus ligandos CXCL9, CXCL10 y CXCL11 en nuestro modelo de enteropatía inducida por p31-43, ya que estudios de nuestro grupo mostraron el rol de este eje quimiotáctico en el reclutamiento celular en la mucosa duodenal en pacientes con enfermedad celíaca activa (Bondar et al. 2014). El aumento de la expresión de CXCL9, CXCL10 y CXCL11 determina el reclutamiento de células CXCR3+ al tejido. Dicho receptor
se encuentra en linfocitos T, linfocitos B y células NK, células que pueden participar de manera relevante en el proceso de daño.
CAPÍTULO 2- Resultados
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Con el fin de evaluar la expresión de las quimoquinas y su receptor, determinamos el nivel de expresión de ARNm mediante una cinética establecida por PCR en tiempo real entre las 2 y las 12hs post-tratamiento, en muestras de intestino de ratones C57BL/6 previamente estimulados con PBS o p31-43.
Como puede observarse en la Figura 2.6, hay un aumento significativo de CXCL9 a las 2hs y de CXCL10 a las 4hs post-tratamiento con p31-43. En cambio, CXCL11 está disminuido a lo largo de todo el período evaluado. En el caso de CXCL9, su aumento es seguido por una disminuido a las 4hs para luego normalizar sus niveles a valores comparables al PBS. Por su parte, los niveles de CXCR3 presentan una leve tendencia al aumento a las 2hs que no es significativa, para luego disminuir su expresión a partir de las 4hs post-tratamiento con p31- 43.
El aumento de la expresión de cualquiera de estos ligandos significará el arribo de células CXCR3+ al tejido. Un patrón de quimoquinas determinado podrá
limitar o activar la respuesta de dichas células dependiendo del estímulo
Figura 2.6. p31-43 induce la expresión de CXCL9 y CXCL10 pero disminuye CXCL11 y CXCR3.
Análisis por PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de CXCL9, CXCL10, CXCL11 y su receptor CXCR3 entre las 2 y 12hs post-tratamiento con p31-43 (puntos negros) o PBS (puntos blancos). Para cada tiempo, todos los valores fueron normalizados con el gen constitutivo HPRT. Todos los resultados fueron expresados como aumento relativo en el tratamiento con PBS y p31-43 versus la media de los valores del tratamiento con PBS en cada punto de tiempo (2-∆∆Ct). N= 4 ratones por grupo, Test t No pareado, *P<0.05, **P<0.01, ratón tratado con p31-43 versus el control de PBS en cada punto de tiempo.
CAPÍTULO 2- Resultados
Figura 2.7. p31-43 induce la expresión de IFNβ e IFNγ.
Análisis con PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de IFNβ, IFNγ y TNFα entre las 2 y 12hs post-tratamiento con p31-43 (puntos negros) o PBS (puntos blancos). Para cada tiempo, todos los valores fueron normalizados con el gen constitutivo HPRT. Todos los resultados fueron expresados como aumento relativo en el tratamiento con PBS y p31-43 versus la media de los valores del tratamiento con PBS en cada punto de tiempo (2-∆∆Ct). N= 4 ratones por grupo, Test t No pareado, *P<0.05, **P<0.01, ratón tratado con p31-43 versus el control de PBS en cada punto de tiempo.
efectuado.
Por otra parte, evaluamos la inducción a nivel de ARNm de diferentes grupos de citoquinas que podrían condicionar la respuesta establecida antes de la inyección intraluminal de p31-43. El análisis por PCR en Tiempo Real de IL-1β, IL- 6 e IL-18 no presentó diferencias significativas entre los animales tratados con p31-43 y los controles de PBS. Sin embargo, las expresiones de IFNβ y de IFNγ
mostraron un incremento significativo entre las 2 y 4hs en el primer caso y a las 4hs en el segundo. Por el contrario, la expresión de TNFα sufrió una disminución significativa por el tratamiento a las 2hs permaneciendo esta tendencia a las 6 y a las 12hs (Figura 2.7).
En paralelo, hemos estudiado otras quimoquinas con el fin de evaluar qué grupos celulares podrían ser reclutados al tejido y participar en la generación de daño por el p31-43. Así fue como evaluamos la expresión de CXCL2, quimioatractante para polimorfonucleares y monocitos y MCP-1, quimioatractante para la línea monocitos/macrófagos. Ninguna de estas quimoquinas fue aumentada por el p31-43. Por el contrario, CXCL2 fue claramente disminuido a las 2hs post-p31-43 continuando esta tendencia en todos los tiempos evaluados (Figura 2.8).
CAPÍTULO 2- Resultados
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Figura 2.8. p31-43 disminuye CXCL2 en intestino delgado de ratones C57BL/6.
Análisis con PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de CXCL2 y MCP1 entre las 2 y 12hs post- tratamiento con p31-43 (puntos negros) o PBS (puntos blancos). Para cada tiempo, todos los valores fueron normalizados con el gen constitutivo HPRT. Todos los resultados fueron expresados como aumento relativo en el tratamiento con PBS y p31-43 versus la media de los valores del tratamiento con PBS en cada punto de tiempo (2-∆∆Ct). N= 4 ratones por grupo, Test t No pareado, **P<0.01, ratón tratado con p31-43 versus el control de PBS en cada punto de tiempo.
Por otro lado, dado que este es un péptido derivado de α-gliadina, deseamos evaluar si p31-43 modula la expresión de IL-15 y la enzima transglutaminasa 2 (TG2), dos moléculas relevantes en la patogenia de EC. No se vio inducida por el tratamiento con p31-43 la expresión a nivel de ARNm de ninguna de estas moléculas. En cambio, la expresión de IL-15 se vio significativamente disminuida en el intestino delgado de estos ratones a las 4hs post-tratamiento (Figura 2.9). Sin embargo, debemos considerar que la determinación de los niveles de ARNm no brinda información a nivel de la funcionalidad de estas moléculas. En particular, en el caso de la actividad de TG2, la cual entre otros roles es necesaria para la deamidación de péptidos de gliadina, está sujeta a cambios conformacionales de la enzima. Por otro lado, IL-15 tiene un complejo sistema post-traduccional de regulación, puede ser almacenada en vesículas y, además, unida a su receptor en superficie (transpresentación), cambios que no son reflejados por modificaciones en los niveles de ARNm (Gaggero et al. 1999).
En conclusión, en ratones C57BL/6, el p31-43 produce un perfil inflamatorio caracterizado por un incremento fuerte de la expresión de IFNγ seguido de IFNβ y CXCL10. El incremento de CXCL10 y su relación con el eje CXCL10/CXCR3+ sería
responsable del reclutamiento de células CXCR3+ al tejido, entre ellas linfocitos T
CD4+ Th1, células que son críticas en EC activa. A su vez, la inducción de IFNγ e
IFNβ claramente puede ejercer un rol relevante en la expansión de la respuesta inflamatoria y en los mecanismos de daño. Entre otros efectos, pueden potenciar la respuesta de los linfocitos T CD4+ Th1 y los linfocitos citotóxicos en la
CAPÍTULO 2- Resultados
Figura 2.9. p31-43 no induce TG2 o IL-15 en intestino delgado de ratones C57BL/6. Análisis con PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de TG2 e IL-15 entre las 2 y 12hs post- tratamiento con p31-43 (puntos negros) o PBS (puntos blancos). Para cada tiempo, todos los valores fueron normalizados con el gen constitutivo HPRT. Todos los resultados fueron expresados como aumento relativo en el tratamiento con PBS y p31-43 versus la media de los valores del tratamiento con PBS en cada punto de tiempo (2-∆∆Ct). N= 4 ratones por grupo, Test t No pareado, *P<0.05, ratón tratado con p31-43 versus el control de PBS en cada punto de tiempo.
cronicidad. Estas observaciones son altamente relevantes ya que le asignan un rol importante al p31-43 en la inducción de daño.