Construcción de la biblioteca parcial de los plásmidos pLPU88a y pLPU88b.

Para la construcción de las bibliotecas genómicas se realizó previamente la purificación de los plásmidos pLPU88aTn5B13 y pLPU88bTn5 como se indica en la sección 2.5. Luego se procedió a la digestión de los mismos con las endonuecleasas de restricción BamHI, HindIII y EcoRI.

Se prepararon cantidades suficientes del vector pG18mob para digerirlo luego con la

enzima correspondiente a los fragmentos elegidos, a saber BamHI, HindIII o EcoRI y se inactivó por calor a 65C. Se procedió entonces a la ligación de los fragmentos en el vector por medio de T4 ADN ligasa (Promega). La selección de los clones se realizó por transformación en E. coli DH α la evalua ió e edio sólido LB suplementado con Gm y X-Gal (5-Bromo-4-cloro-3-indolyl-β-galactopiranósido en una concentración de 40µg/ml) del desarrollo de colonias Gmr que perdieron la capacidad de degradar X-Gal y poseen coloración blanca a diferencia de las que si lo pueden hacer, debido a que incorporaron plásmidos sin inserto y por ello son de color azul.

II.2.10. Clonado

II.2.10.1. Clonado de la zona intergénica (INT) del plásmido pLPU88b. Localización posible del origen de transferencia (oriT).

Para el clonado de la zona intergénica se utilizó como molde el plásmido pLPU88b e hicimos uso de los cebadores denominamos ITGC1 y ITGC2b (Ver tabla de oligonucleótidos) diseñados oportunamente en base a la secuencia consenso producto del apareamiento de secuencias intergénicas presentes en plásmidos de la familia Rhizobiaceae, apilamiento de secuencias realizado en la descripción de la región Dtr. Este caso se usó, según las especificaciones del fabricante, ADN polimerasa Pfx platinium (INVITROGEN) en lugar de la polimerasa mencionada en la descripción de la técnica experimental de PCR.

El producto de amplificación, de 836pb, fue ligado al vector pBBR1MCS5(Gmr), portador de la resistencia a gentamicina y de los genes de movilización compatibles con funciones de transferencia del tipo RK2, previamente digerido con la enzima de restricción SmaI dando lugar al plásmido pINT. La mezcla de ligación se usó para la transformación de células de E. coli DH α ele tro o pete tes. Di ha o stru ió fue orro orada por secuenciamiento.

Las colonias que contenían el plásmido fueron seleccionadas por la adquisición de la resistencia a Gm. La presencia del inserto se corroboró por PCR (amplificación del

47 fragmento específico) en aquellos clones candidatos que mostraron ausencia de actividad -galactosidasa cuando crecían en el medio LB en presencia de X-gal.

Una vez obtenido el plásmido se procedió a la movilización del mismo hacia la bacteria S.meLPU88 desde la cepa de E coli S17-1 portadora de las funciones de ayuda compatibles con los genes de movilización derivados del plásmido RP4 presentes en el vector de clonado. Esta vez la selección de los transconjugantes se realizó en medio TY sólido suplementado con los antibióticos Sm, (resistencia presente en la célula receptora) y Gm (resistencia localizada en el plásmido introducido).

La presencia del plásmido fue nuevamente verificada por PCR mediante el empleo de los cebadores M13F y M13R que poseen sitios de pegado específico localizados en el vector de clonado. Su amplificación incorpora aproximadamente 229pb al tamaño de 836pb esperado para el fragmento clonado.

II.2.10.2. Clonado de los fragmentos C3, C5 y Asm del plásmido pLPU88b.

Determinación de la secuencia mínima con capacidad de promover la movilización.

Para el clonado del fragmento Asm procedimos de la misma manera que describimos previamente para el clonado de la región intergénica (INT) sólo que utilizamos como molde al plásmido pLPU88b e hicimos uso de los cebadores denominamos AsmR y AsmL (Ver tabla de oligonucleótidos) diseñados oportunamente en base a la secuencia consenso producto del apareamiento de secuencias intergénicas presentes en plásmidos de la familia Rhizobiaceae, apilamiento de secuencias realizado en la descripción de la región Dtr.

El fragmento de 238 bp se amplificó con Pfx y se clonó en el vector pBBR1MCS5 digerido con SmaI. Luego de transformar la construcción en E. coli DH α se confirmó por secuenciamiento la presencia del inserto en aquellos clones candidatos que mostraron ausencia de actividad -galactosidasa cuando crecían en medio LB en presencia de X-gal. Luego se procedió a la movilización del plásmido hacia la bacteria SmeLPU88 desde la cepa de E. coli S17-1 dentro de la cual se introdujo previamente por electrotransformación.

La selección de los transconjugantes se realizó en medio TY sólido suplementado con los antibióticos Sm, (resistencia presente en la célula receptora) y Gm (resistencia localizada en el plásmido introducido). La presencia del plásmido en S17-1 fue verificada por PCR utilizando los cebadores Gmf y Gmr y en SmeLPU88Tn a través de la recuperación del plásmido, su posterior transformación en E. coli DH α la o fir a ió por PCR utilizando los cebadores específicos AsmR y AsmF.

48 Para el clonado de las regiones C3 y C5 utilizamos como molde el plásmido pLPU88b e hicimos uso de los pares de cebadores denominamos ITGC3-ITGC2b y ITGC5-ITGC2b (Ver tabla de oligonucleótidos) diseñados oportunamente.

Este caso se usó, según las especificaciones del fabricante, ADN Taq polimerasa (ver descripción de la técnica experimental de PCR).

Los productos de amplificación, de 551pb y 406pb respectivamente, fueron ligados al vector pGemT easy (Ampr). La mezcla de ligación se usó para la transformación de células de E. coli DH α ele tro o pete tes.

Las colonias que contenían plásmido pGemT::C3 y pGemT::C5 fueron seleccionadas por la adquisición de la resistencia a Ampicilina. La presencia del inserto se corroboró por PCR (amplificación del fragmento específico) en aquellos clones candidatos que mostraron ausencia de actividad -galactosidasa cuando se crecieron en medio LB en presencia de X-gal.

Los plásmidos pGemT::C3 y pGemT::C5 fueron digeridos con las enzimas de restricción SphI y PstI, Figura III.4. Los fragmentos liberados, fueron inactivados por calor a 65C y se ligaron al vector pBBR1MCS5 (Gmr) previamente digerido con las mismas endonucleasas dando lugar a los plásmidos pC3 y pC5. Nuevamente la selección de los clones se realizó mediante la transformación de células de E. coli DH α. E las olo ias que resultaron Gmr y que no mostraron la expresión del gen lacZ cuando se crecieron en cajas de medio de cultivo suplementado con X-gal, se verificó la presencia del inserto por PCR utilizando los cebadores específicos. La construcción también fue confirmada por secuenciamiento.

Se procedió entonces a la movilización del plásmido hacia la bacteria S.meLPU88 desde la cepa de E. coli S17-1 dentro de la cual se introdujo previamente por electrotransformación.

La selección de los transconjugantes se realizó en medio TY sólido suplementado con los antibióticos Sm, (resistencia presente en la célula receptora) y Gm (resistencia localizada en el plásmido introducido).

II.2.10.3. Clonado de las regiones de replicación del plásmido pSmeLPU88b.

Para clonar el módulo de replicación correspondiente a la familia repABC utilizamos de plásmido E1 que poseía la secuencia codificante de la proteína RepC (Tabla 1) clonada en el vector pG18mob. El mismo se introdujo por vía conjugativa a la cepa SmeLPU88b y se seleccionaron aquellos transconjugantes con resistencia a Sm, Nm y Gm en los que se

49 había producido, por simple recombinación homóloga, la inserción del vector suicida (interrumpiendo el gen repC durante el evento de recombinación).La correcta integración del plásmido fue verificada por PCR.

Se realizó una digestión enzimática con SmaI del ADN cromosomal de un transconjugante y posteriormente la ligación de los fragmentos. Esto permitió recuperar el plásmido pGrepABC. Este plásmido fue utilizado durante el secuenciamiento realizado por plasmid walking. El mismo posee el fragmento portador de los genes repA, repB y repC.

El clonado de la región que contiene a la proteína RepC de la familia de replicasas repC fue obtenido por amplificación del fragmento flanqueado por los cebadores repC(A)N y repC(A)C utilizando ADN pfx polimerasa y ADN genómico perteneciente a la cepa SmeLPU88 como molde. Dicho fragmento se ligó al vector pK18mob2 previamente digerido con la endonucleasa SmaI. El producto de ligación se electrotransformó en E. coli DH α. Ta to el plás ido pKrepC o o el pGrepABC fuero preparados e introducidos en E. coli S17-1 electrocompetentes y movilizados hacia SmeLPU88 o Sme2011 por conjugación.

II.2.11. Mutagénesis

II.2.11.1. Interrupción del gen mobZ por simple recombinación homóloga.

Para realizar la interrupción, se introdujo por vía conjugativa a la cepa SmeLPU88, el plás ido pB Δsac (contiene un fragmento interno de 500pb comprendido entre los sitios de restricción BamHI y SacI del gen mobZ).

Se seleccionaron aquellos transconjugantes con resistencia a Sm y Gm en los que había sido reemplazado el segmento del gen mobZ durante el evento de recombinación y la consecuente incorporación del vector pG18mob2 portador de la resistencia a Gm. II.2.12.1.1. Estrategia de plasmid walking

Los clones obtenidos, luego de la introducción de un plásmido portador de un fragmento a partir del cual se realizó la integración sitio específica en el lugar a secuenciar, se cultivaron y se realizó la preparación de ADN total, el cual fue digerido posteriormente por una enzima de restricción determinada. Luego de realizada la digestión se procedió a la ligación y a la electroporación en E. coli DH α ele tro o pete tes del uevo lo obtenido, portador de una porción mayor del genoma del plásmido pLPU88b .

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II.2.11.2. Interrupción de los genes repABC y repC por simple recombinación homóloga.

En primer lugar se realizó una simple recombinación homóloga en la secuencia repC(2) perteneciente al sistema de replicación repC. Un fragmento interno de la secuencia repC(2) se amplificó con los cebadores repCMN y repCMC y fue clonado en el vector pK18mob, resultando el plásmido pKrepCmut. Luego fue introducido en la cepa SmeLPU88 por conjugación. Esto permitió la integración del plásmido dando lugar a la interrupción del gen repC(2). Aquellas bacterias en las que se produjo la integración fueron seleccionadas por adquirir resistencia a Nm. La correcta integración fue evaluada por PCR.

La interrupción del gen repC(1) perteneciente al sistema repABC , se realizó a través de la integración del plásmido pKrepABCmut movilizado desde E. coli S17-1 hacia SmeLPU88 por conjugación. El plásmido pKrepABCmut fue construido por amplificación de un fragmento interno del gen repC(1) a partir del plásmido LPU88b, utilizando los cebadores repABCMN y repABCMC y el clonado posterior de dicho fragmento en el vector pK18mob.

II.2.12. Expresión y purificación de proteínas.