Expresión y purificación de la proteína MobZ.

En un primer paso, la secuencia codificante de mobZ fue transferida desde el plásmido pKN que contiene la secuencia codificante completa sin codón de terminación (Materiales y Métodos, sección II.2.15.1) al vector de expresión pET30. La secuencia codificante resultante generó una fusión del extremo C-terminal de MobZ a 6 restos consecutivos de histidina (MobZ-His6). La transformación del plásmido recombinante en

la cepa E. coli BL21 permitió ensayar la inducción de la expresión de MobZ-His6 por

agregado de IPTG, y a posteriori purificar la proteína por cromatografía de afinidad utilizando una resina unida a níquel siguiendo procedimientos estándar Lamentablemente, los intentos de purificar la relaxasa en condiciones nativas a partir de extractos citoplasmáticos de las células inducidas de E.coli BL21 no arrojaron resultados positivos.

Si bien se logró inducir la expresión de la proteína, según puede verse en 3 clones independientes (A, B, y C) de las calles 1, 3, y 5 del gel SDS-PAGE que se muestra en la Figura IV.5, la unión de la proteína nativa a la columna de níquel fue muy débil eluyendo casi en su totalidad de la proteína expresada en las primeras fracciones, a concentraciones de imidazol entre 20-40mM, y acompañada además de otras proteínas como se aprecia en las calles 6, 7, y 8 del SDS-PAGE de la Figura IV.6.

82 A raíz del resultado obtenido, y teniendo en cuenta que la relaxasa de un plásmido de R. etli pudo ser replegada a su forma activa luego de una purificación en condiciones desnaturalizantes, realizamos una purificación en columna pero con la proteína en presencia de urea 8M. Tanto la unión a la columna con níquel como su posterior elución se llevaron a cabo en presencia de urea. A continuación, y para generar condiciones donde la proteína pueda replegarse, se eliminó la urea por diálisis. Con este procedimiento pudo obtenerse una proteína de aproximadamente 92KDa, acompañada de otra proteína de aproximadamente 45KDa, ambas con elevada afinidad por la columna de Ni-NTA, Figura IV.7., calle 6.

El producto de menor peso molecular puede corresponder a una proteína diferente a la relaxasa, o bien a un producto de digestión proteolítica de la misma o generado a partir de una traducción iniciada en un sitio interno del mRNA. El análisis por espectrometría de masas UV-MALDI-TOF de digeridos trípticos de las proteínas de 45KDa y 90KDa reveló la presencia de 2 péptidos comunes a ambas y a la proteína MobZ digerida in sílico con tripsina. Como se muestra en la Figura IV.8. ambos péptidos, de 1164.58KDa y 1377,71KDa, se localizan en el extremo C-terminal de MobZ, hecho que confirma que el

Fig.IV.6: SDS-PAGE correspondiente a la evaluación de la purificación nativa de la proteína MobZ-Hisx6 a partir de un extracto citoplasmático de la cepa E. coli BL21. La figura corresponde a un gel de poliacrilamida 10% obtenido luego de realizada la purificación en condiciones nativas según se describe en Cap. II sección II.2.15.1. Calle1: Marcador de peso molecular. Las flechas de la izquierda indican la posición estimada para componentes de 97KDa y 45KDa, respectivamente. Calle2: Elución con Imidazol 300mM. Calle3: Elución con Imidazol 100mM. Calle4: Elución con Imidazol 40mM. Calle5: Elución con Imidazol 20mM. Calle6: Lavado de la columna con tampón B. Calle7: Volumen eluído que atraviesa la columna. Calle8:Lisado celular

Fig. IV.5: SDS-PAGE correspondiente a la evaluación de la expresión de la proteína MobZ-Hisx6 en la cepa E. coli BL21. La figura corresponde a un gel de poliacrilamida 10% con SDS obtenido luego de la sobreexpresión de los clones A, B y C con IPTG 1mM, durante 3hs. En las diferentes calles se sembraron cantidades equivalentes de células. En todos los casos se observan en los cultivos inducidos (1, 3 y 5) aumentos de intensidad en dos bandas correspondientes a componentes de aprox. 90KDa y 45KDa, respecto de los cultivos no inducidos (2, 4 y 6 )

83 producto de 45KDa corresponde ya sea a un producto de proteólisis de MobZ o a un polipéptido resultante del inicio de la traducción en un codón interno del mismo mRNA de la relaxasa.

Considerando esta última posibilidad, en mobZ y a la altura de los codones de los aminoácidos 405 y 407 existen dos potenciales codones de inicio ATG, con secuencias inmediatamente río arriba ricas en AG, que de ser funcionales como sitios de inicio en E. coli darían lugar a un producto de traducción cercano a 50KDa. Será interesante investigar si la aparición del producto truncado existe también en S. meliloti, o sólo corresponde a un artefacto derivado de la expresión de MobZ en una especie heteróloga. La existencia de proteínas adicionales codificadas dentro del propio gen de una relaxasa (solapamiento génico) es un fenómeno que ya se ha reportado (Francia, M. V., et al., 2004).

Fig. IV.8: Secuencia y localización de los 2 péptidos trípticos comunes a los productos de expresión de 45KDa y 90KDa, y a la proteína MobZ detectados por análisis UV-MALDI- TOF. En la secuencia que se muestra en la figura se indican en gris los 2 péptidos que se localizan en la región C-terminal de ambas proteínas. Masa calculada para el péptido ELVDLYEQR, 1164,58KDa; masa calculada para el péptido AAQLAVDGNSYLR, 1377,71KDa.

Fig. IV.7: SDS-PAGE correspondiente a la evaluación de la purificación en condiciones desnaturalizantes en presencia de urea 8M de la proteína MobZ-Hisx6 obtenida de la cepa E. coli BL21.La figura corresponde a un gel de poliacrilamida 10% obtenido luego de la una purificación en condiciones desnaturalizante según se describe en Materiales y Métodos, sección II.13.1. Calle1: Fracción citosólica cruda. Calle2: Fracción eluída que no se une a la columna(FT). Calle3: Lavado de la columna con tampón B. Calle4: Elución con tampón pH=6. Calle5: Elución con tampón pH=5.3. Calle6: Elución con tampón pH=4. Calle7: Marcador de PM. Calle8: Lisado de células inducidas.

Calle9: Lisado de células sin inducir. Calle10: Eluído con buffer pH=4 (calle 6) luego de la diálisis.

LEIFFGAFTSEWEQRRAALLHEMSSGGRGAWAEEEMRKRLKQVAQL GAVGGGGGSSGTPGGRGPASKGGAAPRAATPAARPMEARLAAIAKG SQPAVVKMASYGGGARVGAMLNYVSRGGELKVENESGRILEGREEL ARIRGDWDHLFQNRAESRDIGSFSVEIAASGFASDEALHEQVRSTL TSGFGDRRYAYAIAKNDGSSVAVQGLVVLRSEQGERLTGDVKAAGI IQGRYDASAAAGEAAAKFSFQGYGNGVEFGASRLRGLVDRHHGVRD DRGQSITNEKVAGDLVQKEWRGELHSRKSRDAMHVIMSARAGTDVA AFEGAVRDFLAHQFAGHRYVFAMHDPASDPKEAGEGGKRPHVHAHA IVAMKSDSGDRIETTPAVFREWRSVMAEKAREHGIEMEMTDRREFA APPAFTRTQVRPVSREGRTEHVGTSEAAQARYDAKRGGRRMVAKSD RSRQYIIKAQETWQRVALAGGDHQIVTYATQHQKCLEASVSTAQTE ASGTVIRADFGSNFRINLATLQEMVLEGQELREMSRAEFEAYEKKV ETALFKLERSVSADDRADFDEVAGLARDFVNQKRELVDLYEQRKEA LAEQGGEAPRSEPREPTNDEWAAAVAKHGEAVVEVGNEAMVEIEHY REGLDRIEAGEFSADRKERMQAGLQQAMERAAQLAVDGNSYLRDVA EQDRDLRQAIDREEKQAEVDRQNDGRADVINRNDDRPMEEKDKTPA NFDAAGEQQRDGSEGEAEGRPIDSKARQDHKLAPTVDATNHLQDRL NKDREAAQLGGEMPRTDPAQQHVSRLKELAREQFEQRERDHGDRDR KLAAALEHHHHHH

84 Teniendo en cuenta la mezcla de dos proteínas que obtuvimos luego de la purificación, que en otras relaxasas el dominio N-terminal con su Motivo I presentó actividad catalítica (Perez-Mendoza, D., et al., 2006), y finalmente que el mutante insercional de la sección IV.3. fue capaz de movilizar el plásmido pSmeLPU88b, resolvimos abordar la expresión de sólo la porción amino terminal de MobZ para eliminar el polipéptido contaminante de 45KDa y ensayar luego la actividad con el producto truncado. Con una estrategia similar, Pérez-Mendoza et al., 2006 reportaron la purificación del dominio N- terminal de la relaxasa del plásmido pRetCFN42d de Rhizobium etli y la medida posterior de su actividad catalítica. En el caso de la relaxasa de este rizobio, la necesidad de construir una proteína truncada no derivó de la aparición de productos espurios sino de la imposibilidad de expresar la proteína completa en E. coli.

Construimos entonces el plásmido pETΔNot Materiales Métodos, sección II.2.15.2) que sólo contiene el fragmento de ADN correspondiente a los primeros 241 aminoácidos de la proteína MobZ fusionados a las 6 histidinas. Como describinos precedentemente, se realizó una purificación en condiciones desnaturalizantes con renaturalización por diálisis. Se obtuvo, de esta manera, una proteína de aproximadamente 22KDa correspondiente al peso molecular calculado. El extracto proteico que contiene la proteí a Mo )ΔNot-H6 fue criopreservado en glicerol y utilizado en los ensayos que se

describen en la sección siguiente.

IV.4.2. Ensayos para evaluar el reconocimiento del oriT por la proteína Mo ZΔNot.