Construcción de mutantes en los genes que codifican flagelinas en

B. japonicum.

Para la construcción de todos los mutantes se eligió una estrategia de doble recombinación homóloga, en la cual se inserta en el genoma una resistencia a antibiótico en reemplazo de los genes de flagelina. La organización de los genes de flagelina de bajo peso molecular (fliCI y II) y alto peso molecular (fliC123 y 4) se muestran en las Figuras V.1 y V.2, respectivamente.

Para llevar a cabo la deleción en fliCI y II (bll6865 y bll6866 respectivamente) la estrategia general de clonado se muestra en la Figura V.1. Brevemente, se amplificó por PCR un fragmento de 393 pb denominado región 1 (reg1), que se encuentra río abajo a bll6865 abarcando la región intergénica y parte de bll6864. Dicho amplicón (Figura V.1.A, gel a) fue clonado en el vector comercial pGemT-Easy (Promega) según las indicaciones del fabricante. Así se obtuvo el plásmido pMJA01, corroborándose por PCR con cebadores M13 y los específicos del fragmento insertado (no mostrado). El mismo procedimiento se realizó con un fragmento de la región intergénica entre bll6866 y bll6867, de 262 pb (Figura V.1.B, gel d), al cual denominamos región 2 (reg2), y al vector que lo contiene pMJA02. Luego, se liberó del plásmido pMJA01 el inserto previamente clonado por digestión con EcoRI y se introdujo el mismo en el plásmido pK18mob,

101

suicida en rizobios (Figura V.1.B, gel b), originando el plásmido pMJA03. El mismo fue chequeado por PCR para obtener la orientación deseada y compatible con el segundo fragmento a clonar (Figura V.1.A, gel c). A partir del plásmido pMJA02 con el inserto reg2 (orientado en la dirección deseada, Figura V.1.B, gel e), se realizó su digestión con PstI y SphI, de modo de posibilitar su posterior clonado de manera orientada en pMJA03, digerido previamente con las mismas enzimas (Figura V.1.B, gel f). El plásmido resultante, denominado pMJA04, fue evaluado por PCR, y se corroboró que contiene ambos fragmentos (Figura V.1.B, gel g), con un sitio de clonado BamHI entre ellos. La digestión con BamHI del plásmido pHP45Ω liberó el casete de resistencia a Sm/Sp, que luego fue introducido en el plásmido pMJA04 digerido con la misma enzima (Figura V.1.B, gel h) para así construir finalmente el plásmido pMJA05, el cual se chequeó por digestión (Figura V.1.C, gel i) y posterior secuenciación. Esta última construcción se movilizó a B. japonicum LP 3004 y LP 3008 por conjugación triparental utilizando el plásmido asistente pRK2013. La primera selección se realizó en cajas YEM Sm/Sp, a favor de aquellas colonias que pudieran presentar simples y dobles recombinaciones homólogas, y en contra de las E. coli portadoras del pRK2013. Posteriormente, las colonias que desarrollaron se picaron cajas réplicas de YEM Sm/Sp/Km y YEM Sm/Sp para detectar los candidatos a haber incorporado el fragmento clonado por doble recombinación homóloga, siendo estos resistentes a Sm/Sp (codificada en el inserto) y sensibles a Km (codificada en el vector). Los candidatos así seleccionados se chequearon por PCR con cebadores específicos de un fragmento del casete de resistencia y de fragmentos río arriba y río abajo de reg1 y reg2 respectivamente (Figura V.1.C, gel j). De esta manera se verificó la presencia del casete y que su ubicación en el genoma fuera la esperada. Los mutantes en la flagelina que forma parte del flagelo fino, confirmados a partir de LP 3004 y LP 3008, se denominaron LP 6865 y LP 6866, respectivamente.

Para obtener los mutantes fliC1234 (bll5843 a 5846) la estrategia de clonado se muestra en la Figura V.2. Brevemente, se amplificó un fragmento de 595 pb, denominado región 3 (reg3), dentro del gen bll5843 y se ligó en el vector comercial pGemT-Easy como en los casos anteriores (Figura V.2.A gel a), obteniéndose así el plásmido pMJA06. La presencia del fragmento fue chequeada por PCR (no mostrado). Luego el fragmento se liberó con EcoRI y se introdujo en el vector suicida en rizobios, pG18mob2 (Figura V.2.A, gel b). SeseleccionólaorientacióndeseadaconloscebadoresespecíficosylosM13

102

A

Figura V.1Estrategia de clonado para la construcción del vector pMJA05 empleado para realizar la deleción de fliCI

y fliCII en B. japonicum. A). Obtención del vector pMJA03. B) Obtención del vector pMJA05. C) Transferencia del vector pMJA05 a B. japonicum y evaluación genotípica del mutante.

103

B

104

C

105

pertenecientes al pG18mob2(V.2.A, gel c).Elplásmidoobtenidosedenominó pMJA07. El segundo fragmento de la recombinación se encuentra ubicado al principio del gen bll5846, fue llamado región 4 (reg4) y su tamaño es de 432 pb. Se amplificó con la ADN polimerasa PFX (Invitrogen) a fin de obtener un fragmento con extremos romos (Figura V.2.B, gel d). Este fragmento fue clonado en el vector pBBR1MCS4 digerido previamente en el sitio SmaI (no mostrado), dando lugar al vector pMJA08, en el cual se corroboró la orientación correcta por PCR con los cebadores M13 y los específicos del inserto (Figura V.2.B, gel e). El fragmento reg4 se liberó del plásmido pMJA08 con XbaI y HindIII y se clonó en estos sitios en el pMJA07 (Figura V.2.B, gel f), obteniéndose el plásmido pMJA09. Este último tiene clonados ambos fragmentos en la misma orientación, debido a que la digestión con XbaI y HindIII introducen el fragmento reg4 orientado en pMJA07. Por digestión (Figura V.2.B, gel g) se corroboró la presencia de ambos fragmentos. Por último, se liberó mediante digestión con BamHI el casete de resistencia a Km de 2 kpb del plásmido pHP45Ω-Km para introducirlo en el plásmido pMJA09 digerido con la misma enzima (Figura V.2.B, geles h-i respectivamente) y así construir finalmente el plásmido pMJA10. Este último vector fue chequeado por digestión (Figura V.2.C, gel j) y posterior secuenciación. Al igual que en el caso anterior, la construcción se movilizó a B. japonicum LP 3004, LP 3008 y ahora también a LP 6865 y LP 6866 por conjugación triparental utilizando el plásmido asistente pRK2013.

En este caso la primera selección se realizó en cajas YEM/Sm/Km (para candidatos en el acervo de LP 3004 y LP 3008) o YEM/Sm/Sp/Km (para candidatos en el acervo de LP 6865 y LP 6866) a fin de seleccionar a favor de los simples y dobles recombinantes y en contra de las E. coli portadoras del pRK2013, y en una segunda ronda, se seleccionó los candidatos a haber incorporado el inserto por doble recombinación homóloga como aquellas colonias resistentes a Km (codificada en el inserto) y sensibles a Gm (codificada en el vector). Además, los candidatos se chequearon por PCR con cebadores específicos de un fragmento del casete Km y de fragmentos río arriba y río abajo de reg3 y reg4, respectivamente, para corroborar la presencia del casete y que su ubicación en el genoma de B. japonicum fuera la esperada (Figura V.2.C gel k). En este último caso se obtuvieron los mutantes en las flagelinas que componen el flagelo grueso derivados de LP 3004 y LP 3008, a los que se denominó LP 5843 y LP 5844, y los dobles mutantes delecionados en ambos tipos de flagelina en el acervo de LP 3004 o LP 3008, denominados LP 6543 y 6644, respectivamente.

106

A

Figura V.2Estrategia de clonado para la construcción del vector pMJA10 empleado para realizar la deleción de

fliC1-4 en B. japonicum. A). Obtención del vector pMJA07. B) Obtención del vector pMJA10. C) Transferencia del vector pMJA10 a B. japonicum y evaluación genotípica del mutante.

107

B

108

C

109