Procedimientos microbiológicos

II.4.1 Conservación de las bacterias

Para mantener a largo plazo las cepas, se crecieron previamente hasta fase logarítmica tardía en YEM o LB según fuesen rizobios o E.coli respectivamente, y se

47

suplementaron con glicerol al 25% (v/v) y 50% (v/v) para su conservación a -20 °C y - 80°C.

Para uso rutinario, alícuotas de estas reservas se hicieron crecer en YEM sólido con los antibióticos correspondientes y se mantuvieron a 4°C por períodos que no excedieron de 60 días.

II.4.2 Cultivos bacterianos y preparación de inóculos

Para la mayoría de los ensayos, los cultivos se iniciaron a partir de reservas en medio sólido mantenidas a 4°C y se hicieron crecer en el medio de Götz 28°C con agitación rotatoria a 180 rpm hasta saturación. Este cultivo se diluyó 1:100 en el mismo medio fresco y se dejó crecer durante tres días para asegurar que todas las células estuvieran en fase exponencial. A partir de este cultivo iniciador, se realizaron diluciones 1:50 en los medios a estudiar y se continuó su cultivo en las mismas condiciones hasta la fase de crecimiento deseada. Exceptuando la dilución final, las restantes se hicieron con el agregado del antibiótico correspondiente.

El crecimiento en medio de Götz semisólido se realizó inoculando las placas con un palillo en la parte central y permitiendo el crecimiento durantes 13 a 15 días. Las placas se colocaron en estufa a 28°C con la tapa hacia arriba y cubiertas con parafilm para evitar su desecación.

II.4.3 Estimación de la biomasa y recuento en placa

La biomasa se estimó por lecturas de densidad óptica a la longitud de onda indicada, 500 nm para B. japonicum y 600 nm para E. coli. El número de células viables se estimó por recuento en placa de las unidades formadoras de colonias (UFC ml-1) sobre el medio YEM. Los recuentos se realizaron por triplicado. Previamente se había determinado que el recuento de las UFC en el medio YEM sólido arrojaba los mismos resultados que en Götz sólido (López García, 2004). Las placas se incubaron a 28°C y las colonias fueron visibles a partir de los 5 días. De forma alternativa, se empleó el método de la gota para realizar los recuentos de UFC (Hoben et al., 1982), en el cual se colocan gotas de 5 µl, en las que se puede contar entre 5 y 40 UFC. Se colocaron de 10 a 15 gotas por dilución y se realizaron 3 diluciones por placa.

48

II.4.4 Antibióticos

Los antibióticos se prepararon en agua bidestilada (exceptuando la espectinomicina, que se preparó en metanol) a una concentración 1.000 X y se esterilizaron por filtración por membrana (filtros Millipore de 0,22 µm). Las concentraciones finales en los medios de cultivo fueron (en µg ml-1):

-Para Escherichia coli: kanamicina sulfato (Km) 25 µg ml-1, ampicilina (Ap) 200 µg ml-1, estreptomicina (Sm) 100 µg ml-1, espectinomicina (Sp) 100 µg ml-1, y gentamicina (Gm) 10 µg ml-1.

-Para B. japonicum.: Km 150 µg ml-1, Sm 400 µg ml-1, Sp 200 µg ml-1 y Gm 100 µg ml-1.

II.4.5 Preparación de células electrocompetentes de E. coli

La preparación de células electrocompetentes fue realizada segun Tung y Chow (1995), con leves modificaciones. Se inocularon 300 ml de medio LB sin NaCl, con 1 ml de un cultivo de la cepa E. coli DH5α, que había sido crecida desde el día anterior. El cultivo fue incubado a 37°C y agitado a 180 rpm en agitador orbital hasta que se alcanzó una densidad óptica a 600 nm de 0,6 unidades; momento en el cual se procedió al enfriamiento del cultivo en agua hielo durante 30 minutos. Luego, las células se centrifugaron 15 minutos a 4.000 x g. y se lavaron con 50 ml de glicerol 10% frío. Este procedimiento se realizó dos veces a 4°C. Las bacterias se resuspendieron suavemente en glicerol 10% frío y se fraccionaron en alícuotas de 100 µl, que se conservaron -80°C.

II.4.6 Electrotransformación de células electrocompetentes de E. coli

Los vectores plasmídicos construídos requeridos se introdujeron en células electrocompetentes de E. coli DH5α y S17-1, mediante la técnica de electrotransformación. Para este procedimiento se utilizó un equipo Gene Pulser (Bio- Rad) y cubetas comerciales de 0,2 cm de ancho (Gene Pulser Cuvette Bio-Rad), bajo las condiciones recomendadas por el fabricante (25µF, 200 Ω, 2,5 kV). Inmediatamente después de la electrotransformación, se adicionó a las células 1 ml de medio LB fresco, y la mezcla se incubó 1 hora a 37°C para permitir que los plásmidos introducidos se replicaran. Pasado este tiempo, se plaquearon las bacterias en medio LB sólido selectivo y se incubaron el tiempo necesario en estufa a 37°C.

49

II.4.7 Conjugaciones triparentales

Las conjugaciones fueron realizadas empleando la técnica de Simon (Simon et al., 1989) con modificaciones menores según se indica a continuación. Las cepas aceptoras de B. japonicum fueron crecidas en el medio PSY sin antibiótico durante 5 días hasta una DO500nm aproximada de 0,5 unidades. Las cepas de E. coli se diluyeron a medio LB fresco

sin antibiótico 3 o 4 horas antes de la conjugación y se dejaron alcanzar una DO620nm

similar. Las cepas de E. coli que se utilizaron fueron la DH5α con el plásmido que se desea transferir y la que lleva el plásmido pRK2013 (Figurski & Helinski, 1979), el cual aporta en trans los genes necesarios para la movilización.

Para realizar la conjugación se mezclaron 0,4 ml de cada una de las cepas de E. coli con 0,7 ml del cultivo de la cepa receptora en un tubo de polipropileno de 1,5 ml y se centrifugaron a 640 x g durante 8 minutos. El precipitado fue resuspendido suavemente en 50-75 µl del mismo medio. Dicho resuspendido fue colocado en placas de PSY sólido en forma de gota y se incubó durantes durante 48 horas a 28°C. Luego la gota fue resuspendida en 1 ml de medio YEM fresco y plaqueda en el/los antibiótico/s correspondiente/s para la selección de transconjugantes. El mismo procedimiento se realizó como control para cada una de las cepas.