7 CULTIVOS CELULARES
7.2. CULTIVOS DE CELULAS OSTEOBLASTICAS
7.2.1. Cultivos de células osteoblásticas de origen animal
Inicialmente, la mayoría de los cultivos de células osteoblásticas eran obtenidos de animales jóvenes, recién nacidos o fetales. Así, se han obtenido cultivos celulares derivados de calota fetal de rata 156, 172, 173, 177, 181, 188, 194, 195, 199, 205, 207, 208, 213, 215, 217, 219 de calota neonatal de rata 45, 150, de calota neonatal de ratón 177, 193, 209, 210, de hueso de embriones de pollo 51, 52 y bovino fetal 33. En estos casos, el hueso obtenido es fragmentado y sometido a digestión secuencial con colagenasa, obteniéndose la población celular.
También se han obtenido clones celulares como el cultivo de células MC3T3- E1, clon de línea osteoblástica de calota de ratón 180, o el cultivo de células UMR 201 que es un clon de células no transformadas derivadas de calota neonatal de rata 223. La utilización de estos clones celulares evita el potencial de crecimiento de células no osteoblásticas, disminuyendo el riesgo de contaminación por otras series celulares.
Sin embargo, aunque estos cultivos exhiben diversas propiedades y características típicas de osteoblastos, el comportamiento de estas células dista de ser análogo del de las células óseas humanas adultas debido al distinto desarrollo (embriones, fetos, neonatales) y a diferencias interespecies. En los estudios realizados se han observado diferencias en relación con las diversas especies animales pudiendo, por tanto, modificar la información aportada por el estudio y no siendo, como consecuencia, modelos apropiados para el estudio de la fisiopatología ósea humana.
7.2.2. Cultivo de células osteoblásticas tumorales
Otro tipo de cultivo de células osteoblásticas es el establecido a partir de tumores óseos, fundamentalmente de sarcoma osteogénico. Se han obtenido cultivos a partir de osteosarcoma de rata y humano. Las líneas celulares ROS 17/2 30, 33, 43, 175, 179, 182, 204, ROS 17/2.8 41, 149, 179, 195, 200, 206, 219, ROS 2/3 182, OS 12 175, UMR 106 33 y UMR 106-01 55 son clones de líneas celulares de sarcoma osteogénico de rata. Entre las líneas celulares derivadas de osteosarcoma humano destacan: MG-63 53, 157, 186, 190, 211, 224, SAOS-2 53, 190, 220, TE-85 157, 190 y U2 OS 157, 190.
Las líneas celulares derivadas de osteosarcoma permiten la utilización de grandes cantidades de células genotípicamente homogéneas que retienen su fenotipo tras múltiples pases de cultivo. Son fáciles de cultivar dado su rápido crecimiento y pueden ser útiles para el estudio de los efectos de un factor simple en un medio definido así como para el aislamiento de productos sintetizados por estas células.
Sin embargo, son células transformadas y aunque presentan algunas características del fenotipo osteoblástico, no expresan el fenotipo completo del osteoblasto humano. Así, difieren en sus procesos de control de crecimiento, organización citoesquelética, expresión de oncogenes y producción de factores de crecimiento. Por este motivo, pueden responder anormalmente a hormonas o factores de crecimiento, como consecuencia de procesos relacionados con la transformación tumoral de las células.
7.2.3. Cultivo de células osteoblásticas humanas
La introducción del cultivo de osteoblastos humanos ha permitido la obtención de un modelo experimental más fidedigno para el estudio de la patología metabólica ósea, evitando las posibles conclusiones erróneas al utilizar otro tipo de cultivos celulares que, como consecuencia, no permitiera una extrapolación de sus resultados a lo que sucede “in vivo”.
7.2.3.1. Aislamiento
Para el aislamiento de células óseas humanas se desarrollaron una serie de métodos:
- a partir del estroma óseo: obteniéndose cultivos de médula ósea de los que se derivan células que sufren una diferenciación osteoblástica, capaces de sintetizar proteínas óseas como osteonectina u osteocalcina 53, 189, 220-222, 225
- a partir de periostio: se han establecido cultivos de osteoblastos humanos obtenidos de periostio de huesos largos como fémur 226 o cúbito 227. Las muestras obtenidas son fragmentadas y mantenidas en medio de cultivo hasta que las células osteoblásticas inician su crecimiento a partir de los explantes de periostio. Estas células poseen la capacidad de diferenciarse en osteocitos y formar tejido óseo humano calcificado “in vitro” 226.
- a partir de hueso trabecular: El método original descrito por Beresford 31 permite la obtención de células semejantes a osteoblastos humanos por crecimiento a partir de fragmentos de hueso trabecular adulto 46, 53, 185-187, 212, 214, 228, 229.
Una variación de esta técnica es el método utilizado por Marie 230, en el que se produce una migración sobre una malla de nylon de las células proliferadas desde la superficie trabecular ósea. Con ello se evita la contaminación con células de la médula ósea al no adherirse éstas a la malla. Posteriormente esta malla es transferida a placas de cultivo y las células adheridas a la malla separadas mediante tripsina y posteriormente cultivadas hasta su confluencia. 231-236.
Además del método de Beresford, uno de los más utilizados es el método de Robey -Termine 237. El hueso trabecular humano obtenido para cultivo, una vez fragmentado, es sometido a una digestión secuencial con colagenasa. Con ello se evita la contaminación de células de la médula ósea (hematopoyéticas, adipocitos) así como del tejido conectivo (fibroblastos). Posteriormente, los fragmentos óseos son sembrados para el inicio del crecimiento celular 2, 6, 24, 157, 190, 198, 220.
- finalmente, otro método de obtención de cultivo de células con características osteoblásticas ha sido a partir de células aisladas tras pretratamiento con colagenasa 220, 228, 237, 238: En este caso se utilizan las células liberadas en el sobrenadante tras tratamiento de los explantes óseos con colagenasa. El problema reside en que podemos detectar en este cultivo la producción de colágeno tipo III, lo que es indicación de contaminación fibroblástica.
7.2.4. Cultivo de células osteoblásticas humanas modificadas
- Otro tipo de cultivos utilizados son las células HOBIT (human osteoblast-like initial transfectant). Esta es una línea celular establecida a partir de hueso trabecular humano adulto transferido con el plásmido pSV3neo, que incluye secuencias y promotores para los antígenos T del virus SV-40 (virus simio 40) 157, 239. Aunque presentan características osteoblásticas, a diferencia de los osteoblastos humanos su proliferación es más rápida y no muestran actividad adenilato ciclasa en respuesta a tratamiento con PTH (1-34).
Otras líneas celulares similares son:
- FOB en la que el virus SV-40 se ha transferido a hueso trabecular fetal humano 157.
- SV-HFO 9, derivada de calota humana inmortalizada con el virus SV- 40. Al ser una línea inmortalizada, pierde parte de las características osteoblásticas, y tiene una naturaleza más mesenquimal, mostrando escasa actividad fosfatasa alcalina y mínima producción de osteocalcina.