Dado que las muestras fueron preparadas y sembradas en el gel de manera tal de tener

similar masa de polipéptidos en caso de solubilización completa de los mismos en el buffer muestra de electroforesis, estos resultados sugieren una insolubilización de los polipéptidos (posiblemente por agregación) debida a los tratamientos con los fluidos gastrointestinales, en correlación con la disminución de solubilidad proteica previamente descripta, que no logra ser revertida por la presencia de SDS en el buffer muestra de electroforesis. Cuando las muestras fueron tratadas con 2-ME, el perfil electroforético de Ac2,3 (Figura 1.1.A, calle 8) fue similar al de A, presentando únicamente una intensidad algo menor las bandas de más de 45 kDa. Estos resultados sugieren que la agregación estuvo mediada (al menos parcialmente) por puentes disulfuro. Luego de la digestión gastrointestinal simulada, se observó una fuerte disminución en la intensidad de todas las bandas en todos los digeridos; de hecho, no se pudieron observar bandas con la coloración de Coomasie Blue (no mostrado). Algunas bandas aparecieron en la coloración con plata, demostrando que algunos polipéptidos permanecieron sin ser hidrolizados (Figura

1.1.A, calles 3, 4 y 5). Se registraron algunas diferencias entre los digeridos en la cantidad

relativa de cada uno de los polipéptidos remanentes. Por ejemplo, Ad1 presentó mayor intensidad que Ad2 y Ad3 en bandas correspondientes a polipéptidos mayores de 45 kDa, mientras que Ad3 mostró mayor abundancia que Ad1 y Ad2 de polipéptidos entre 20 y 30 kDa y menores (Figura

1.1.A, calles 3 y 5). Sin embargo, es importante tener en cuenta que la cantidad de polipéptidos

intactos detectada es muy baja (la sensibilidad de la tinción con plata está en el orden de 0,5-1 ng, mientras que la cantidad total de proteína sembrada en los geles fue del orden de 30 µg), indicando una muy baja proporción de polipéptidos no hidrolizados en todos los casos.

Se realizaron corridas en geles de tricina-SDS-PAGE a fin de poder observar la composición de péptidos de baja masa molecular. A presentó bandas correspondientes a masas moleculares mayores a 30 kDa en la parte superior del gel correspondientes a las subunidades ácidas de la globulina 11S y otras mayores que no ingresan, así como otras entre 20 y 30 kDa (polipéptido básico de la globulina 11S) y diversas moléculas menores correspondientes a albúminas, incluyendo una banda de alrededor de 6 kDa (Orsini Delgado y col., 2011) (Figura 1.2, calle 1). Igual que en el caso de la SDS-PAGE, se observaron modificaciones luego del tratamiento con los fluidos oral, gástrico e intestinal sin enzimas (Ac2,3), tales como disminución de la intensidad de varias bandas, especialmente aquellas de masas moleculares mayores a 16,95 kDa, y aparición de otras de mayores masas que permanecen en el gel espaciador (Figura 1.2, calle 2). Luego de la digestión enzimática, todas las bandas disminuyeron su intensidad, permaneciendo detectables

solo algunas (Figura 1.2, calles 3, 4 y 5). Los resultados indican que la hidrólisis proteica produjo principalmente péptidos de baja masa molecular (menor a 6 kDa) que no pudieron ser detectados en el gel. Nuevamente, se pueden evidenciar algunas diferencias entre los distintos digeridos, las más importantes fueron la mayor la intensidad de una banda algo mayor a 30 kDa y otra de alrededor de 16 kDa en el caso de Ad3, mientras que Ad1 mostró mayor intensidad en bandas de mayor masa que no ingresan al gel separador. En este caso, la coloración con plata no mostró información adicional respecto a la de Coomasie Blue.

Figura 1.1. SDS-PAGE de las muestras liofilizadas. En ausencia de 2-ME: A (calle 1) y Ac,3 (calle 2) (tinción con Coomasie Blue), Ad1 (calle 3), Ad2 (calle 4), Ad3 (calle 5) (tinción con plata). En presencia de 2-ME: A (calle 7) y Ac2,3 (calle 8). Calle 6: patrón de baja masa molecular.

Figura 1.2. Tricina-SDS-PAGE de las muestras liofilizadas. En ausencia de 2-ME: A (calle 1) y

Ac,3 (calle 2) (tinción con Coomasie Blue), Ad1 (calle 3), Ad2 (calle 4), Ad3 (calle 5) (tinción con

plata). En presencia de 2-ME: A (calle 7) y Ac,3 (calle 8). Calle 6: patrón de baja masa molecular.

Las electroforesis muestran dos conclusiones importantes: 1) el tratamiento con fluidos gastrointestinales producen insolubilización por agregación de polipéptidos de más de 20 kDa

97 66 45 30 20,1 14,4 1 2 3 4 5 6 7 8 97 66 45 30 20,1 14,4 26,6 16,95 14,4 6,5 1 2 3 4 5 6 7

mediada al menos parcialmente por puentes disulfuro; 2) la composición peptídica de los tres digeridos presenta solo algunas pequeñas diferencias en las cantidades relativas de los polipéptidos que permanecen sin hidrolizar, en el caso de Ad1 permanecen sin hidrolizar mayor proporción de polipéptidos mayores a 45 kDa y en el caso de Ad3 se observa mayor permanencia de polipéptidos menores a 25 kDa; 3) para los tres digeridos analizados los productos de hidrólisis son fundamentalmente péptidos con masas moleculares menores a 6 kDa

La composición molecular de las fracciones solubles in buffer fosfato 35 mM (pH = 7,8) fue analizada mediante cromatografía de filtración en gel usando una columna Superdex Peptide 10/300 GL (analítica) que permite visualizar moléculas menores a 10 kDa. De esta manera, también fue posible comprobar el efecto del tratamiento de A con los fluidos gastrointestinales (según Minekus y col., 2014) sin enzimas (Ac2,3), evidenciándose una disminución muy importante en el pico correspondiente al volumen de exclusión de la columna (masas moleculares > 10 kDa) y, dado que los cromatogramas fueron normalizados a igual masa de proteína, un incremento relativo de la intensidad de las moléculas de bajas masas moleculares solubles (Figura 1.3.A). Por lo tanto, la disminución de solubilidad registrada para esta muestra involucra fundamentalmente moléculas mayores a 10 kDa, lo cual está de acuerdo con lo observado en las electroforesis. Un efecto similar había sido ya registrado para Ac1 (Orsini Delgado y col., 2011), sugiriendo que diferentes condiciones de los fluidos gastrointestinales (distinta composición y concentración de sales, distintos pHs, distintos tiempos de incubación) produjeron cambios comparables en las proteínas, presumiblemente la agregación de globulina-p.

Luego del tratamiento con las proteasas digestivas, los tres digeridos presentaron un incremento importante de moléculas con masas menores a 6,5 kDa, mientras que las moléculas de mayores masas (> 10 kDa) disminuyen fuertemente, permaneciendo solo pequeños picos (Figura 1.3.B,