Efecto sobre la actividad de enzimas antioxidantes y contenido de GSH.

SOD, CAT y GPx son las principales enzimas antioxidantes que minimizan la cascada de ROS y eliminan los peróxidos citotóxicos en las células. Los cambios en las actividades de las enzimas antioxidantes celulares así como el contenido de GSH y su relación con el contenido GSSG se pueden considerar como biomarcadores de la respuesta antioxidante.

Se determinó el efecto de las muestras sobre el contenido de GSH y sobre la actividad enzimática de SOD y GPx frente a la inducción del estrés oxidativo. Para ello, se llevó a cabo el siguiente protocolo:

1. Obtención de monocapas de Caco-2 TC7: Las células se sembraron en una placa de 48 pocillos en una concentración de 6,25 x 104 células/pocillo y se incubaron durante 6 días en estufa (37 ºC, 5 % CO2). Se retiró el medio y se lavó con PBS.

2. Tratamiento con la muestra (T1): Se agregaron 200 μL de muestra en buffer fosfato pH = 7,8 y se incubó 1 h en estufa. Se retiró y se lavó con PBS.

3. Inducción del estrés oxidativo (T2): Se agregaron 200 μL de una solución de H2O2 (Rieder-del-

Haën) 500 µM en PBS y se incubó 1 h. Se retiró y se lavó con PBS.

4. Lisis celular (T3): Las células de cada pocillo se levantaron incubando con tripLE durante 5 min en estufa. Se agregaron 200 μL de PBS, se transfirió a un tubo de microcentrífuga y se centrifugó a 600 x g durante 5 min. Se descartó el sobrenadante y se agregaron 75 µL de buffer de Lisis 1X (provisto en kit comercial de determinación de GSH). Se mezcló y se incubó durante 15 min en baño de hielo, se centrifugó durante 10 min a 16000 x g y se reservó el sobrenadante almacenándolo a -80 ºC para las determinaciones de la actividad de las enzimas y el contenido de GSH.

Al igual que en los ensayos anteriores, se realizaron los controles de oxidación correspondientes:  Control 1 (C1): Control de máximo estrés oxidativo. En el T1 las células se incubaron con

buffer fosfato pH 7,8 en lugar de muestra y luego se realizó la inducción del estrés oxidativo con el H2O2 como se hizo con las células tratadas con muestra (T2).

 Control 2 (C2): Control de oxidación basal. Estas células no fueron tratadas con muestras ni sometidas a estrés oxidativo; en T1 y T2 fueron incubadas con buffer fosfato 35 mM, pH 7,8 y PBS respectivamente.

En todos los casos fue necesario optimizar las condiciones de reacción. A continuación se describen los protocolos finales para cada determinación.

3.7.1. Actividad de superóxido dismutasa

Como se explicó anteriormente, la SOD cataliza la dismutación del anión superóxido (O2•˗) en

H2O2 y O2. El kit comercial utilizado (19160 SOD determination kit, Sigma-Aldrich) permite el

análisis de actividad de la SOD mediante la sal monosódica de tetrazolio (WST-1, (2-(4-yodofenil)- 3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio, sal monosódica) capaz de producir formazán (λmax

= 450 nm) soluble en agua al reducirse por acción del O2•˗. Los iones O2•˗ se generan a partir de la

conversión de xantina y O2 en ácido úrico y H2O2 por la xantina oxidasa (XO). La adición de SOD

a esta reacción reduce los niveles de O2•˗, lo que reduce la velocidad de formación de formazán y

produce una disminución de la absorbancia a 450 nm. La actividad de SOD en la muestra experimental se mide como el porcentaje de inhibición de la velocidad de formación de formazán (Esquema 3.3) (Peskin y Winterbourn, 2000).

Esquema 3.3. Reacciones involucradas en la determinación de SOD.

Para la determinación se mezclaron 20 µL de sobrenadante con 200 µL de solución de trabajo WST. Luego se agregaron 20 µL de solución enzimática (XO), se mezcló y se incubó a 37 ºC durante 60 min y se leyó la absorbancia a 450 nm en un lector de microplacas (BIOTEK INSTRUMENTS, SYNERGY-HT). El blanco de la reacción se realizó de igual manera pero los 20 µL de muestra fueron remplazados por agua MiIliQ. La actividad de SOD (% de inhibición de la formación de formazán) se calculó mediante la siguiente ecuación, tomando los valores de absorbancia a 45 min (Ecuación 3.4):

Actividad SOD = (Ablanco - Amuestra)/(Ablanco) x 100 Ecuación 3.4

Los resultados se expresaron como porcentaje de C1, control de máxima oxidación. 3.7.2. Glutatión Peroxidasa

Este conjunto de enzimas catalizan la reducción de peróxido de hidrógeno (H2O2) y una amplia

variedad de peróxidos orgánicos (R-OOH) a los correspondientes alcoholes estables (R-OH) y agua usando glutatión celular como reactivo reductor. Se utilizó un kit comercial (Glutathione Peroxidase Cellular Activity Assay Kit, Sigma-Aldrich, CGP1) que emplea un método de determinación indirecta. Se basa en la reacción de oxidación de GSH a GSSG catalizada por GPx, que luego se acopla al reciclaje de GSSG de nuevo a GSH utilizando glutatión reductasa (GR) y

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NADPH. La disminución en la absorbancia de NADPH medida a 340 nm durante la oxidación de NADPH a NADP+ es indicativa de la actividad de GPx, ya que GPx es el factor limitante de la velocidad de las reacciones acopladas (Esquema 3.4).

Esquema 3.4. Reacciones involucradas en la determinación de GPx.

El kit provee como reactivo iniciador el t-Bu-OOH pero dado que este también es un sustrato para la glutatión S-transferasa para la determinación sobre los sobrenadantes celulares la reacción se inició agregando H2O2 en una concentración final de 0,2 mM y procediendo como indican las

recomendaciones del kit: la catalasa debió bloquearse mediante la adición de NaN3 en una

concentración final de 1 mM y el pH del buffer de ensayo se ajustó a 7 dado que a un pH mayor habrá una reacción espontánea de H2O2 con GSH. El ensayo se realizó a 25 ºC. Se mezclaron 10

µL de reactivo de ensayo NADPH con 10 µL de sobrenadante y 40 µL de NaN3 5 mM. La reacción

se inició agregando 10 µL de H2O2 4 mM. Para llevar el volumen final de la reacción a 200 µL se

utilizó el buffer de ensayo mantenido a 25 ºC y a pH = 7. Se determinó la disminución de la absorbancia a 340 nm midiendo cada 10 seg durante 60 seg, posterior a un tiempo de reposo inicial de 15 seg (lector de microplacas BIOTEK INSTRUMENTS, SYNERGY-HT). Paralelamente a las muestras se realizó un blanco en el que la muestra se reemplazó por buffer de ensayo (máxima absorbancia). La actividad de la GPx en la muestra se determinó mediante la siguiente ecuación (Ecuacion 3.5):

Actividad (mmol/min/mL = U/mL) = (A/min)blanco - (A/min)muestra/(6,22 x V) Ecuación 3.5

Donde:

(A/min) = Diferencia de absorbancia por minuto = (A65seg-A5seg)/(60 seg)

6,22 =  (mM) del NADPH V = Volumen de muestra (mL)

Los resultados se expresaron como porcentaje de C1, control de máxima oxidación. 3.7.3. Contenido de glutatión reducido

Para la determinación de GSH en los sobrenadantes se utilizó un kit comercial (Glutathione Assay Kit, Fluorimetric. Sigma, CS1020). Este kit se basa en la utilización de la sonda monoclorobimano, que puede pasar libremente a través de la membrana plasmática. La sonda libre muestra muy poca fluorescencia pero cuando se une al GSH (Esquema 3.5), en una reacción catalizada por la glutatión S-transferasa (GST), forma un aducto fuertemente fluorescente (λexc = 390 nm, λem = 468

nm) (Fernández-Checa y Kaplowitz, 1990).