1’por lo que
11.2.10.5. Determinación de la composición y secuencia aminoacídica de las bacteriocinas
Las fracciones que contenían las bacteriocinas purificadas de E. faeciumPl 3 y E. faecium T136 se desecaron a vacío en un rotavapor y se enviaron al Dr. Knut Sletten del Centro de Biotecnología de la Universidad de Oslo para determinar su composición y secuencia annnoacídica.
La composición antinoacídica de las bacteriocinas se determiné empleando un analizador automático de aminoácidos (“Biotronic”). Las muestras se hidrolizaron completamente con exceso de HCl 6 N por calentamiento a l00-l20~C durante 10-24 horas. Con este tratamiento el triptófano se destruye, la concentraciónfinal de treonina y serma disminuyen ligeramente y la asparragina y la glutamina se hidrolizan, originándose ácido aspártico y ácido glutámico, respectivamente. El análisis automáticose realizó mediante una columna de intercambio catiónico con una resma de poliestireno sulfonada como matriz cromatográfica. Una vez equilibrada la resma con una solución de NaOH, se aplicó la mezcla de aminoácidos de la muestra a analizar (pH 3,0) y se procedió a la elución de los distintos aminoácidos con soluciones de pH y concentraciones de sal crecientes. Los aminoácidos más básicos (lisina, arginina, histidina), se adhieren fuertemente, mientras que los más ácidos (glutámico,aspártico) se fijan débilmente. Las diversas fracciones eluidas se analizaroncuantitativamente medianteuna reacción colorimétrica empleando ninhidrinacomo reactivo colorimétrico.
La secuencia aminoácidica de las bacteriocinas se determinémediante degradación de Edman sometiéndolas a ciclos consecutivos de degradación en un microsecuenciador de fase gaseosa conectado a un analizador automático (“Applied Biosystems”) de derivados feniltiohidantoina- aminoácido por sistema HPLC (Cornwell a aL, 1988). En la reacción de Edman el feniltioisocianato, bajo condiciones alcalinas, reacciona con el grupo amino terminal no cargado del péptido formando un feniltiocarbamilato-aminoácido, el cual bajo condiciones ácidas suaves se libera en forma de un derivado cíclico de la feniltiohidantoffia (PTH), dejando el resto de la cadena peptídica intacta. El derivado PTH-aminoácido liberado se identifica cromatográficamente por medio de un sistema HPLC. Cuando e] extremo N-terminal de la cadena peptídica está bloqueado por la presencia de aminoácidos modificados, la muestra se somete a un tratamiento con bromuro de cianógeno (Sletten, 1974), que rompe la cadena peptídica sólamenteen el lado carboxflico de los residuos de metionina, sometiéndose posteriormente el fragmento (2-terminal de la cadena a la degradación de Edman. Los aminoácidos modificados, como la lantionina, ji metil-lantionina y/o sus precursores, no se detectan por la degradación de Edman, por lo que la muestra se somete a una oxidación con ácido perfórmico, que producirá ácido cístico a partir de
la lantionina.
111. Materia.) y Métodos
111.2.10.6. Determinación del tamaño molecular de las bacteriocinas por espectrometría de masas
Muestras que contenían las bacteriocinas purificadas de E. faeciumP13 yE. faecium1136, se enviaron al Dr. J. Metzger del Instituto de Química Orgánica de la Universidad Eberhard- Karls de Ttibingen (Alemania) con el objeto de determinar su tamaño molecular mediante espectrometría de masas.
La base de la espectometría de masas es la producción de iones, los cuales son separados o filtrados de acuerdo a su relación masa/carga (M/Z) y detectados posteriormente. Los espectómetros de masas son instrumentos altamente sofisticados y computerizados que, básicamente, constan de cinco panes: la zona de introducción de la muestra, el lugar de ionización de la misma, el analizador de la masa, la zona de detección de iones y el procesador de los datos obtenidos.
111.2.10.7. Efecto del dititritol (DTT) en la actividad antimicrobiana de las
bacteriocinas
Los grupos tiol o sulhidrilo (-SH) de los residuos de cisteina son extremadamente susceptibles a la oxidación por el oxígeno atmosférico en presencia de sales de hierro u otros oxidantes suaves. El producto de la oxidación es la cistina, en la que el enlace disulfuro constituye un puente covalente entre dos restos de cisteina (-S-S-). La cistina desempeña un papel esencial en la estructura de la proteína, ya que su grupo disulfuro actúa como un enlace covalente transversal entre dos cadenas polipeptídicas o entre dos puntos de una misma cadena. Los enlaces disulfuro establecidos pueden escindirse por la acción de agentes reductores, tales como el ditiotritol (DTF) o el fr-mercaptoetanol.
111.2.1O.7.l. Microorganismos indicadores
Los microorganismos indicadores empleados fueron E. faedum 1136, en el caso de la enterocina P y E. faeciumP13, en los casos de las enterocinas A y B.
111.2.10.7.2. Ensayos en níacas microtituladoras
La determinación del efecto del DTT en la actividad antimicrobiana de las bacteriocinas se realizó empleando un ensayo en placas microtituladoras, similar al descrito en la sección 111.2.10.3.4. Los microorganismos indicadores se desarrollaron en caldo MRS (“Difco”) a 3IFC durante 16 horas y, posteriormente, se diluyeron (1/400) en caldo MRS-D’fl’ 10 mM hasta una absorbancia a 620 nm de aproximadamente 0,1. En los primeros pocillos de las placas microtituladoras se depositaron 9 ~ilde las bacteriocinas purificadas (isopropanol al 50%) y 1 jíl de MRS-DTT lM, completando con caldo MRS hasta un volumen final de 100 ¿l. A continuación, se realizaron diluciones seriadas en caldo MRS-Dfl 10 mM. Como controles se
emplearon 9 pi de isopropanol al 50% y 1 pi de MRS-Dfl’ 1M, así como, 9 itt de las
bacteriocinas purificadas y ljil de MRS. Una vez diluidas las bacteriocinas y los controles se añadieron a cada pocillo 150 pi del microorganismo indicador diluido en caldo MRS o MRS-
~rr
10 mM y las placas se incubaron a300(2durante 12-14 horas. Finalizada la incubación. seIII. Material y Métodos
determinó espectrofotométricamente a 620 nm el crecimiento de los microorganismos indicadores, empleando un lector de placas microtituladoras. La actividad antimicrobiana de las muestras se expresó en UR/mí, determinándose el porcentaje de reducción de esta actividad en las muestras tratadas con DU.
111.2.10.8. Determinación de la concentración inhibidora mínima (CIM) de las bacteriocinas purificadas a homogeneidad frente a diversos microorganismos de
interés en la industria alimentada
111.2. 10.8. 1. Microorganismos indicadores
Las bacterias Gram-positivas empleadascomo microorganismos indicadores, así como los medios de cultivo y condiciones de incubación empleados para su desarrollo, se muestran en la Tabla 111.1.
111.2.10.8.2. Ensayos en placas microtituladoras
La determinaciónde la concentración inhibidora mínima (CIM)de las bacteriocinas se realizó empleando un ensayo en placas microtituladoras, similar al descrito en las secciones 111.2.10.3.4 y 111.2.10.7. Los microorganismos indicadores se desarrollaron en el medio apropiado y a la temperatura adecuada durante 16 horas y posteriormente se diluyeron (1/400) en el caldo estéril correspondiente, hasta una&20 de aproximadamente 0,1. En los primeros pocillos de las placas
microtituladoras se depositaron alícuotas, de concentración conocida, de las bacteriocinas purificadas, completando con el caldo estéril adecuado hasta un volumen final de 100 ¡.11. A continuación, se realizamn diluciones seriadas en el caldo correspondiente y, seguidamente, se afíadieron a cada pocillo 150it1 del microorganismo indicador. Las placas se incubaron, en las condiciones de temperatura y tensión de oxígeno requeridas por los microorganismos indicadores, durante 12 horas, en el caso de las bacterias lácticas, deMÍCrOCOCCUS varíans (M.
varians) y de los microorganismos anaerobios obligados, y durante 6/8 horas, en el caso de
Bacillus cereus (B. cereus), Ls. innocua, Ls. nwnoCytogenes, St. carnosus y St. aureus.
Finalizada la incubación, se determinó espectrofotométricamente a 620 nm el crecimiento de los microorganismos indicadores, empleando un lector de placas microtituladoras. La CIM se define como la concentración de bacteriocina (ng/mí) que inhibe en un 50% el desarrollo del microorganismo indicador.