MATERIAL Y MÉTODOS
111.1.5 SOLUCIONES, TAMPONES Y GELES
Los productos químicos empleados fueron siempre de calidad reactivo y se adquirieron de las firmas “Merck”, “Probus”, “Sigma”, “Fluka”, “Panreac”, “Carlo Erba”, “Serva” y “Bio- Rad”.
111.1.5.1. Tampón de resuspensión de los sobrenadantes libres de células
concentrados
Es una solución de fosfato sódico 4 mM, pH 7,0. Para su elaboración se prepararon las siguientes soluciones:
(1) Solución de Na2HPO4 4 mM, pH 9,6
Se suspenden 0,56 g de Na2HPO4 en 600 ml de agua destilada y se calienta hasta su disolución; se trasvasa a un matraz aforado de 1.000 ml y se enrasa con agua destilada. (2) Solución de NaH2PO4• H20 4 mM, pH 4,5
Se suspenden 0,54 g de NaH2PO4• H20 en 600 ml de agua destilada y se procede de la manera descrita para la solución (1)
El tampón de fosfato sódico 4 mM, pH 7,0 se prepara añadiendo la solución (2) a la (1), con agitación continua, hasta que se alcanza un pH de 7,0.
111.1.5.2. Soluciones y tampones empleados para la identificación y filiación taxonómica de las bacterias lácticas seleccionadas mediante el análisis de su patrón electroforético de proteínas totales en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE)
111.1.5.2.1. Tamoón salino de fosfato sódico (NaPBS
) Contiene: g/l NaCí 8,0 Na2HPO4.12H20, 0.2M 40,5 ml NaH2PO4.2H20, 0,2M 9,5 mi Preparación:
Se mezclan las 2 soluciones y se disuelve el cloruro sódico; una vez homogeneizada la disolución se trasvasa a un matraz aforado de 1.000 ml y se enrasa con agua desionizada. La solución se esteriliza en autoclave a 1210C durante 15 mm.
111.1.5.2.2.
Taimnón de resuspensión de la muestra(51W
Condene: g/WOmJ
Tris 0,75
~-meitaptoetanol 5,00 ml
Glicerol 10,00 ml
Preparación:
Se mezclan los componentes y una vez disueltos se trasvasa la mezcla a un matraz aforado de
100
mí, que se enrasa con con agua desionizada. La solución se esteriliza en autoclave a 1210CIII. Material yMétodos durante 15 mm. 111.1.5.2.3. Solución de SDS al 20% (p/v ) Contiene: g/lOOml SDS 20,0 Preparación:
El SDS
se incorpora lentamente a100
ml de agua desionizada caliente y la solución se mantiene en agitación en una placa calefactora hasta su disolución.111.1.3.3. Soluciones y tampones empleados durante la purificación a
homogeneidad de las bacteriocinas y su caracterización bioquímica
111.1.5.3.1. Solución de Na,11P94 0.5 M
Contiene: gil
Ña2HPO4 70,98
pH 9,6
Preparación:
Se suspende la sal en 600 ml de agua destilada y se calienta hasta lograr su disolución; se trasvasa a un matraz aforado y se enrasa a 1.000 ml con agua destilada.
111.1.5.3.2. SQ1JJ~IáaJ~N2II2~4JI2QQ.5M
Contiene: gil
NaH2PO4~H2O 68,89
pH 4,5
Preparación:
Se procede de manera análoga a la descrita para la solución anterior.
111.1.5.3.3. Tampón de fosfato sódico 10 mM. pH 5.8 (Tampón NaP. pH 5.8
)
A
partir de la solución de Na2HPO4 0,SM se prepara una solución deNa2HPO4 10
mM. Para ello se vierten20
ml de la solución de Na2HPO4 0,5M en un matraz aforado de 1 litro y se enrasa con agua desionizada. La solución final tiene un pH aproximado de 9,6.A.partir de la solución de NaH2PO4~ H20
0,SM
se prepara una solución de NaH2PO4• 112010
mM. Para ello se procede de igual forma que en el caso anterior. La solución final tiene un pH aproximado de 4,5.Para preparareltampón
NaP 10
mM,pH 5,8
se añade la solución de Na2HPO4 10 mM, pH 9,6 ala solucióndeNaH2P04~H20 10
mM, pH 4,5 hasta que se alcanzael valor de PH deseado(5,8).
Esta solución se denominará en adelante tampón NaP, pH 5,8.111.1.5.3.4.
Solución de NaCí iMen tampón NaP. pH 5.8Contiene: g/500 ml
NaCí 29,22
Preparación:
Se disuelve la sal en 300 ml de tampón NaP, pH 5,8, se trasvasa la solución a un matraz aforado
III. Material y Métodos
de 500 ml y se enrasa con el mismo tampón.
111.1.5.3.5. Solución de sulfato amónico al 10% (dv)en tampónNaP. pH 5.8
Contiene: g/100m1
Sulfato amónico io,o
Preparación:
Sedisuelvela sal en 100 ml deltampón NaP, pH 5,8.
111.1.5.3.6. Solución de etanol al 70% (y/y) en tampón NaP. nH 5.8
Contiene: muíooml
Etanol 30.0
Preparación:
Se vierte el alcohol en un matraz aforado de 100 ml y se enrasa con eltampón NaP, PH 5,8. 111.1.5.3.7. Solución de etanol al40%(y/y
)
Contiene: ml/500ml
Etanol 200,0
Preparación:
Se vierte el alcohol en un matraz aforado de 500 ml y seenrasa con agua destilada 111.1 .5.3.8. Solución de isodropanol al70%(vi’.’).pH 2
Contiene: mI/500ml
Isopropanol (“Merck”> 350,0
Preparación:
Se vierte el alcohol en un vaso de precipitado y se añaden 100 ml de agua destilada, tras lo cual se ajusta el pH de la solución con HCl12N. Posteriormente se vierte la solución en un matraz aforado de 500 ml y se enrasa con agua destilada
Contiene: mill
Ácido trifluoroacético (ATF, “Merck”) 1.0
Preparación:
Se disuelve el ATF en 900 mIde agua desionizada, se trasvasa la solución a un matraz aforado de 1.000 ml y se enrasa con agua desionizada. Una vez preparada la solución, se hacepasar a través de filtros de 0,22 j.tm de diámetro de poro, con ayuda de una bomba de vacio.
111.13.3.10. Tamnón B
Contiene: mi/l
Ácido trifluoroacético 1.0
Preparación:
Se procede como se hadescrito para el tampón A, excepto que en este caso el disolvente es 11 de isopropanol.
fIL Materia)y Métodos 111.1.5.3.11. Solución de ditiotritol en caldo MRS <“Difco”) (MRS-DTT. lM
)
Contiene: g/s mí
UIT(“Merck”) 0,77
Se prepara caldo MRS (“Difco”) como se describió en la sección 111.1.4.1.3 y. a continuación, se disuelve el agentereductor DTT en 5 ml del medio de cultivo. A partir de la solución resultante
(
MRS-DU 1M), se prepararon 100 ml de caldo MRS-DTI7 10 mM.111.1.5.4. Soluciones y tampones empleados para el aislamiento del ADN cromosómico y plasmídico 111.1.5.4.1. Solución de NaCí al0.9% (p/v ) Contiene: g/lOOml NaCí 0,9 Preparación:
Se disuelve la sal en 100 ml de agua desionizada y, posteriormente, se esteriliza en autoclave a 1210C durante 20 mm.
111.1.5.4.2. Solución de Tris-HCl lM. oH 8
Contiene: g/500 ml
Trisnia-baseanhidro(“Sigma”> 60,55
Preparación:
Se disuelve elTrisma-baseen 300 ml de agua desionizaday se ajusta el pH a8.0 con HCl 12N. Seguidamente se enrasa con agua desionizada hasta 500 ml y se esterilizaen autoclave a 1210(2 durante 20 mm.
111.1.3.4.3. Solución de EDIA 0.25 M. pH 8.0
Contiene: g/i000 ml
Titriplex III (.2 H20) (EDIA, “Sigma”) 93,05
Preparación:
Se disuelve el EDTA en 600 ml de agua desionizaday se ajustael PH a 8,0 con NaOH iON. Se enrasa con agua desionizada hasta 1000 ml y se esteriliza en autoclave a 1210C durante 20 mm.
Es una solución de sacarosa 7,7% (p/v), Tris Base anhidro 50 mM y EDTA 1 mM, pH 8,0.
Contiene: gibO ml
Sac~wsa 7,7
Tris-UCI lM, pH 8,0 (“Sigma”) 5,0 ml
EDIA 0,25 M, pH 8,0 0,4 ml
Preparación:
Se mezclan los componentes en un vaso de precipitado con un poco de agua desionizada. Se trasvasa la mezcla a un matraz aforado de 100 ml y se enrasa con agua desionizada. La solución se esteriliza pasándola a través de filtros de 0,45 gm de diámetro de poro.
¡II. Material y Métodos
111.1.3.4.5. Tamnón ltD
Es una solución de Tris-HC1 25 mM, EDTA 10 mM, pH 8,0 y glucosa 50 mM.
Contiene: g/100m1
Glucosa 0,99
Tris-HCI 1M, pH8,0 2,50 ml
EDTA O,25M, pH8,0 4,00 ml
Preparación:
Se mezclan los componentes en un vaso de precipitado con un poco de agua desionizada. Se trasvasa la mezclaa un matraz aforado de 100 ml y se enrasa con agua desionizada. La solución se esteriliza a través de filtros de 0,45 pxm de diámetro de poro.
111.1.3.4.6. Solución de lisozima (SmgIml
)
Se disuelven 5 mg de lisozima en 1 ml del tampón TED y posteriormente la solución se esteriliza con filtros de 0,45 ¡.tm de diámetro de poro.
111.1.5.4.7. Solución de EDTA 0.5 M. pH 8.0
Contiene: g/1000 ml
Titriplex III (.2 H20) 186,12
Para su preparación se procede de manera análoga a la descrita en la sección 111.1.5.4.3.
111.1.3.4.8. Tampón ET
Es una solución de Tris-HCl 50 mM y EDTA 250 mM, pH 8,0.
Contiene: ml/SOml
Tris-HCI lM, pH 8,0 2,5
EDTA O,5M 25.0
Preparación:
Se mezclan los componentes y una vez disueltos se trasvasala mezcla a un matraz aforado de 50 ml y se enrasa con agua desionizada. La solución se esteriliza en autoclave a 12 10(2 durante 20 mm.
111.1.5.4.9. Tamnón de SDS al 20% (p/v
)
Es una solución de SDS al 20% (plv), Tris-HCl 50 mM y EDTA 20 mM, pH 8,0.
Contiene: g/bOOml
SDS 20,0
Tris-HCI, 1M,pH 8,0 5,0 ml
EDTA 0,25 M pH 8,0 8,0 ml
Preparación:
Se mezclan los componentes y se disuelven con agitación y calor. Una vez enfriada la solución, se trasvasa a un matraz aforado de 100 ml y se enrasa con agua desionizada. La solución se esteriliza en autoclave a 121 0C durante 20 mlii.
111.1.5.4.10. Solución deNaOH 3M
Contiene: g/lOOmI
¡XL MaterialyMétodos
NWJH 12,0
Preparación:
Esta solución se prepara inmediatamente antes de su empleo. Se disuelve la sal en 80 ml de agua desionizada, se trasvasa la solución a un matraz aforado de 100 ml y se enrasa con agua desionizada.
111.1.3.4.11. Solución de Tris-HCl 2M. pH 7.0
Contiene: g/250 ml
Trisma-base anhidro 60,55
Preparación:
Se disuelve el Trisma-base en agua desionizada y se ajusta el pH a 7,0 con 1 ó 2 gotas de HCl 1 2N. Seguidamente se enrasa con agua desionizada hasta 250 ml y se esteriliza en autoclave a 1210C durante 20 mm.
111.1.5.4.12. Solución de NaCí 5M
Contiene: g/100 ml
NaCí 29,25
Para su preparación se procede de la manera descrita en la sección 111.1.5.4.10.
111.1.5.4.13. Solución de fenol-Tris (1:1
)
Es una solución de fenol redestilado en solución salina (0,9% NaCí). La 8-hidroxiquinolina es un antioxidante que evita la oxidación del fenol, siendo también un débil quelante de iones metálicos y un inhibidor parcial del enzima ARNasa. Esta sustancia proporciona además una coloración amarilla, que facilita la identificación de las fases líquidas separadas.
Contiene:
Fenol (“Merck”) 1 vol
Tris 2M, pH 7,5 1vol
8-Hidroxiquinolina (“Serva”) 0,1%
Preparación:
El fenol se licua en un baño regulado a 800C y se añade un 0,1% de hidroxiquinolina para retardar la oxidación del fenol y colorear la solución. Se añade un volumen de Tris 2M. PH 7,5 y se deja con agitación a40(2hasta la separación de las fases polar y apolar. La fase inferior se elimina por aspiración con una bomba de vacío. A continuación se repite la operación empleando dos volúmenes de agua destilada. Finalmente se retira la fase acuosa (superior) y la solución de fenol-Tris se conserva a ~20ÓCen un envase opaco. Esta solución es muy corrosiva, por lo que debe manipuiarse siempre con guantes y en una cabina de aspiración de aire.
111.1.5.4. 14. Solución de cloroformo-alcohol isoamilico <24:1
)
Contiene:
Cloroformo 24 vol
Alcohol isoamuico 1 vol
Preparación:
Se mezclacuidadosamente el cloroformo y el alcohol isoaniflico, en una cabina de aspiración de
fIL MaterialyMétodos
aiiv, y la solución resultante se conserva a temperatura ambiente.
111.1.5.4.15. Solución de fenol-Tris cloroformo-isoamilico (1:1
)
Contiene:
Fenol-Tris ¡vol
Clorofonno-a]coho¡ isoamflico ¡vol
Preparación:
Se mezclan ambas soluciones en una cabina de aspiración de aire. La solución resu]tante se conserva a40(2 en un envase opaco, durante un periodo máximo de una semana.
111.1.5.4.16. Tamnón TE. pH 7.5
Es una solución de Tris-HCl 10 mM y EDTA 1 mM, pH 7,5.
Contiene: ml/250 ml
Tris.HCI 1M, pH ‘7,5 2,5
EDTA 0,25M, pH 8,0 1,0
Preparación:
Se mezclan los componentes y se enrasa con agua desionizada en un matraz aforado de 250 ml. La solución se esteriliza en autoclave a 1210C durante 20 mm.
111.1.5.4.17. Solución de ARNasa(1m2/ml’> CrampónTER
)
Se disuelven 100 jIl de una solución de ARNasa (10 mg/mí) en 900 gI de tampón TE. La solución resultante se conserva a ~200C.
111.1.5.4.18. Tampón de acetato sódico 3M. pH 7.0
Contiene: g/100m1
Acetato sddico 24,60
Preparación:
Se disuelve la sal en 80 mIde agua desionízada y se ajusta el pH con ácido acéticoglacial diluido; se trasvasa la solución a un matraz aforado de 100 ml y se enrasa con agua desionizada. La solución se esteriliza en autoclave a 1210C durante 20 min.
111.1.5.5. Soluciones, tampones y geles empleados para la visualización del
ADN cromosómico y plasnídico
111.1.5.5.1. Solución de EDTAO.5M. pH 8.0 Ver sección 111.1.5.4.7.
111.1.3.5.2. Geles dea2arosa
Los geles de agarosa al 0,8 y 2% (plv) se realizaron con agarosa SeaKem LE y Nu Sieve 3:1, respectivamente, ambas suministradas por “FMC Bioproducts”.
111.1.5.5.3. Tampón de Tris-acetato <TAE 50K
>
Contiene: g/l
III. Materialy Métodos
Tris-base 242,0
Ácido acéticoglacial 57,1 ml
EDIA 0,5 M pH 8,0 100,0 ml
Preparación:
Se mezclan las dos soluciones y se disuelve el Tris-base; seguidamente se trasvasa la solución a un matraz aforado de 1.000 ml y se enrasa con agua desionizada. La solución se esteriliza en autoclave a 121 0C durante 20 mm. El TALE 50x se mantiene a temperatura ambiente y sirve de solución madre para preparar el tampón TALE lx (Tris-acetato 40 mM, EDTA lmM).
111.1.5.5.4. Solución de transporte (10K
>
Esta solución aumenta la densidad de las muestras, permitiendo que el ADN se introduzca adecuadamente en los pocillos del gel; además, al contener azul de bromofenol permite la visualización del frente electrofor~tico.
Contiene: millo inI
(Blicerol 5,00
Agua desionizada 4,75
Solución TALE (40 x)pH 7,2 250,00 gí
Azul de bromofenol (“Merck”) 25,00 mg
Preparación:
Se mezclan los componentes y, una vez disueltos, se alicuotala solución en viales de 1 ml que se mantienen a 40C 6 a -200C.
111.1.5.3.5. Solución de bromuro de etidio (BrEO (10 ma/ml
)
El bromuro de etidio (BrEt) es un compuesto fluorescente que se intercala entre las bases del ADN y que emite fluorescencia a 590 mix, en la región rojo-naranja del espectro visible. Es un compuesto mutagénico y tóxico, por lo que las soluciones deben manipularse siempre con guantes y tomando las precauciones oportunas.
Se preparó una solución madre de BrEt (10 mg/ml de agua desionizada) que se conservó a temperatura ambiente en un frasco opaco.
111.1.3.6. Tampones empleados para la preparación de células competentes de
E. cotí DH3a
111.1.5.6.1. Tampón IB
Es una solución PIPES lOmM (Piperazina-N’,N’-bis-2-etano sulfónico, “Sigma”), CaCI2 15 mM, KCI 2SOmM, MnCl2 SSmM. Contiene: g/200 ml PIPES 0,60 MnCI2.2H,O 1,77 KCI 3,73 Soluciónde CaCI2 lM 2,00 ml pH 6,7 Preparación:
Se disuelventodos los componentes en 150 ml de agua desionizada y se ajusta el pH con KOH 1M. La solución se trasvasa a un matraz aforado de 200 mí, se enrasa con agua desionizada y se
¡II. Materialy Métodos
esteriliza con filtros de 0,22jmde diámetro. La solución se conserva a40(2~
111.1.5.7. Soluciones y tampones empleados para la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR)
Los desoxinucleótidos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) fueron suministrados por la casa “Pharmacia” en viales individuales que contenían el dNTP correspondiente a una concentración de 100 mM, pH 7,5.
El MgCl2 empleado como cofactor en la reacción y el tampón lOx ([NH4]2504 200 mM, Tris-HCl 750 mM, pH 9,0, Tween 0,1% (p/v) fueron suministrados por la firma “Advanced
Biotechnologies LTD”.
El aceite mineral utilizado para evitar la desecación de las muestras fue suministrado por “Sigma”. El agua desionizada empleada se esterilizó en autoclave a 1210(2 durante 20 min.
111.1.5.8. Soluciones y tampones empleados para la secuenciación del ADN 111.1.5.8.1. Tampón S¡ndin2 & Wash(B&W)2x
Es una solución de NaCí 2M, Tris-HCI 10 mM y EDTA 1 mM, pH 7,5.
Contiene: ml/lOO ml
Tris-HCI lM, pH 7,5 1,0
EDTA 0,5 M 0,2
NaCí SM 40,0
Preparación:
Se mezclan las 3 soluciones y, seguidamente, se trasvasa la solución resultante a un matraz aforado de 100 ml y se enrasa con agua desionizada. Esta solución se mantiene a temperatura ambiente y sirve de solución madre para preparar el tampón B&W lx.
1II.LI.3.8.2. SolucióndeNaOH0.lN Contiene:
NaOl-l 2,0
Preparación:
Se suspenden las lentejas de sosa en 400 ml de agua desionizada. Una vez atemperada la solución se trasvasa a un matraz aforado de 500 ml y se enrasa con agua desionizada.
111.1.3.8.3. Tampón TE. oH 7.5 Ver sección 111.1.5.4.16.
111.1.3.8.4. Solución de HCl 1M
Contiene: ml/lOO ml
HCI comercial (Riqueza: 37%; densidad: l,199kg/l) 8,3
Preparación:
Se mezcla el HCl con 80 ml de agua desionizada y se trasvasa la solución a un matraz aforado de 100 mí, enrasándose a continuación con agua desionizada. A partir de esta solución se prepararon 50 ml de una solución de HCl 0,2M, la cual se esterilizó en autoclave a l21~C durante
fIL MaterialyMétodos
20 mm.
111.1.5.8.3. Solución de Tris-HCl lM. pH 7.5
Se prepara como se describió en la sección 111.1.5.4.2, pero ajustando el pH a 7,5.
III.l.5.8.6. TanipónTBE lOx
Contiene: g/l
Tris-base 108,0
Ácido bórico 55,0
~2 EDTA 9,3
Preparación:
Se disuelven los componentes en 600 ml agua destilada. La solución resultante se trasvasa a un matraz aforado de 1.000 ml y se enrasa con agua desionizada.
111.1.3.8.7. Solución de acrilamida bis-acrilaxnida (40% p/v
)
Contiene: g/l
Aailamida (“Bio-Rad”) 38,0
N, Ntmetilén.bis acrilamida(”Bio-Rad”) 2,0 Preparación:
Se mezclan los componentes en 40 mi de agua desionizada y se disuelven en una placa calefactora. Una vez enfriada la soluci6n se trasvasa a un matraz aforado de 100 ml y se enrasa con agua desionizada. La solución se conserva en un envase opaco a40(2durante 1 ó 2 semanas. La acrilamida es una sustancia muy tóxica por lo que siempre que se utilice se deben proteger las manos con guantes y emplear una mascarilla.
III. 1.5.8.8. Solución de persulfato amónico (5PM (25% pI’.»
)
Condene: mg/ml
Persulíato amónico 250
Preparación:
Se disuelve el persulfato amónico en 1 ml de agua desionizada. La solución se conserva a ~200C.
111.1.5.8.9. Solución de acrilamida (6% v/v’l urea (6M’i
Contiene: ml/lOO ml
Tampón TBE ¡Ox 9,0
Acrilamidabisacrilamida(40%) 13,5
U’ea (“Rio-Pal”) 41,4 g
Preparación:
Se mezclan los componentes con 10 ml de agua desionizada en un vaso de precipitado y se mantiene en una placa calefactora con agitación suave hasta su disolución. Una vez enfriada la solución, se trasvasa a una probeta de 100 ml y se añade agua desionizada hasta 90 ml. A continuación la solución se hace pasar a través de filtros Whatman n0 1 para eliminar los restos de cristales de urea. La solución debe preparasejusto en el momento de su empleo y conservarse en hielo fundente.
III. MaterialyMétodos
111.1.3.8.10. Solución de N.N.N. N’-tetra-metfl-etiléndianxina (TEMED
)
Es una solución comercial suministrada por la casa “Bio-Rad”. Esta sustancia se adiciona, junto a la SPA, a la solución de acrilamida (6% y/y) con urea (6M) para la preparación de los
geles de secuenciación (sección 111.2.11.10.6.1).
111.1.5.8.11. Solucióndelavadoyfijación
Es una solución de ácido acético al5% (y/y)y metanol al 15% (y/y).
Contiene: ml/l
Ácidoacético 50,0
Metanol 150,0
Agua desionizada
800,0
Esta solución se conserva a temperatura ambiente y se puede reutilizar hasta 5-7 veces.