Determinación de las constantes cinéticas K d,app y k pol para el ensayo de

ATPasa de las enzima 2C wt y 2C(I248T)

Se han determinado las constantes cinéticas Kd,app y kpol (afinidad y eficiencia catalítica, respectivamente) de la actividad ATPasa de las enzimas 2C y 2C(I248T) tanto en ausencia como en presencia de poli(A) o poli(U) (Figura 5.25). Con ellas se han determinado las eficacias catalíticas (Kcat) de ambas enzimas (kpol/ Kd,app) (Tabla 5.13).

Kcat de 2C wt es 1,8 x 10-5 µM-1 s-1 (Kd,app y kpol de 112±17 µM y 0,0020±0,0001 s-1, respectivamente). En presencia de poli(A), el valor de Kd,app disminuye levemente (88±12 µM) mientras que se incrementa sustancialmente kpol (0,0090±0,0004 s-1), aumentando así 5 veces la eficacia catalítica respecto al ensayo en ausencia de RNA. (Kcat = 10 x 10-5 µM-1 s-1). En presencia de poli(U) aumentan tanto Kd,app como kpol (223±40 µM y 0,0030±0,0002 s-1, respectivamente) con respecto a la ausencia de RNA, por lo que la eficacia catalítica no aumenta respecto a la ausencia de RNA (1,3x10-5 _µM-1 _s-1_{). Estos datos están de acuerdo con los} mostrados en el apartado 5.4.3 e indican que poli(A), pero no poli(U), estimula la actividad ATPasa de 2C.

Estos mismos experimentos se realizan con la proteína 2C(I248T). En ausencia de RNA, 2C(I248T) presenta valores de Kd,app y kpol de 19±3 µM y 0,00020±0,00006 s-1, respectivamente (Tabla 5.13). Esto indica que la afinidad por ATP es 5 veces superior que la de 2C wt, aunque la velocidad máxima de la reacción es 10 veces menor. La eficacia catalítica de 2C(I248T) es 0,8x10-5 _µM-1 _s-1_{, un valor 2 veces inferior al de la enzima wt. En presencia de} poli(A) tanto Kd,app como kpol aumentan considerablemente (82±12 µM y 0,004±0,0002 s-1, respectivamente) lo que resulta en un aumento de 5 veces en la eficacia catalítica (Kcat = 5 x 10-5 µM-1 _{x s}-1_{). Este valor es, de nuevo, 2 veces inferior al de la enzima wt. Sin embargo, el dato} más significativo es que 2C(I248T), a diferencia de 2C wt, es fuertemente estimulada por poli(U). En presencia de poli(U), el valor de Kd,app (16±3 µM) se mantiene constante mientras

que el valor de kpol aumenta 20 veces (0,0030±0,0001 s-1) con respecto a la ausencia de RNA. Por tanto, la eficacia catalítica aumenta 15 veces (19 x 10-5 µM-1 x s-1). En definitiva, la eficacia catalítica ATPasa de 2C wt es 2 veces superior a 2C(I248T) tanto en ausencia como en presencia de poli(A), mientras que la eficacia catalítica de 2C(I248T) es 15 veces la de 2C wt en presencia de poli(U). Este dato sugiere que el cambio I248T afecta fuertemente a las propiedades bioquímicas de 2C.

Figura 5.25 Determinación de parámetros cinéticos Kd,app y kpol de 2C y 2C(I248T) para el ensayo de actividad

ATPasa. a) Representación de la velocidad de reacción (kobs) en función de concentraciones crecientes de ATP con 2C wt en ausencia o presencia de poli(A) (120ng/µl) ó poli(U) (120ng/µl). Los datos experimentales se ajustan a una hipérbola en cada caso. b) Igual que en a) utilizando 2C(I248T); obsérvese las diferencias en las escalas de abscisas y ordenadas entre a) y b). Los procedimientos para la realización de los ensayos de actividad ATPasa con 2C se detallan en el apartado 4.28 de Materiales y Métodos. La representación gráfica así como la obtención de la ecuación de las distintas hipérbolas se realiza con el programa KaleidaGraph (Synergy Software).

Tabla 5.13 Valores de las constantes cinéticas de 2C y 2C(I248T) para el ensayo de actividad ATPasa.

ENZIMA Kd,app (µM) kpol (s-1) kpol/Kd,app (µM-1 x s-1)

2C wt 112±17 0,0020±0,0001 1,8 x 10-5 2C wt + poli(A) 88±12 0,0090±0,0004 10 x 10-5 2C wt + poli(U) 223±40 0,0030±0,0002 1,3 x 10-5 2C(I248T) 19±3 0,0002±0,0001 0,8 x 10-5 2C(I248T) + poli(A) 82±12 0,0040±0,0002 5 x 10-5 2C(I248T) + poli(U) 16±3 0,0030±0,0001 19 x 10-5

Valores de Kd,app y kpol del ensayo de ATPasa en ausencia de RNA, o presencia de poli(A) o poli(U) para las enzimas 2C wt y 2C(I248T) obtenidos a partir del análisis de las gráficas que se muestran en la Figura 5.25. Se muestra el valor de eficacia catalítica (Kcat) calculado como kpol/Kd,app.

5.4.5 Determinación de las constantes cinéticas K

y k

para el ensayo de

actividad GTPasa de las enzima 2C wt y 2C(I248T)

Al igual que para la actividad ATPasa, se determinaron también los parámetros cinéticos Kd,app y kpol de las enzimas 2C wt y 2C(I248T) para el ensayo de actividad GTPasa (Figura 5.26).

En ausencia de RNA, la eficacia catalítica es 1,1 x 10-5 _µM-1 _s-1 _{(Tabla 5.14). Este valor} es 2 veces inferior al valor obtenido en actividad ATPasa en ausencia de RNA (comparar Tabla

5.14 con Tabla 5.13). En presencia tanto de poli(A) como de poli(U), los valores de Kd,app y kpol aumentan, aunque la eficacia catalítica en ambos casos es 0,9 x 10-5 _µM-1 _s-1_{. Estos datos están} de acuerdo con los mostrados en el apartado 5.4.2 e indican que la eficacia catalítica de 2C wt para el ensayo de actividad GTPasa no está influida por la adición de RNA aunque sí modifica los parámetros Kd,app y kpol.

En el caso de 2C(I248T), la eficacia catalítica de actividad GTPasa es 0,6 x 10-5 µM-1 s-1 (Tabla 5.14), 2 veces inferior que en 2C wt. En presencia de poli(A), los valores de Kd,app y kpol aumentan, al igual que ocurre con 2C wt en estas condiciones, aunque la eficacia catalítica en presencia de RNA (0,4 x 10-5 µM-1 s-1) no varía significativamente. Sin embargo, en presencia de poli(U), al igual que ocurre en el ensayo de actividad ATPasa, el valor de eficacia catalítica aumenta 20 veces (11 x 10-5 _µM-1 _s-1_{) con respecto a la ausencia de RNA. Este aumento se debe} tanto a la disminución de Kd,app, como al aumento de kpol (Tabla 5.14). En definitiva, la eficacia catalítica (ATPasa y GTPasa) de 2C wt es 2 veces superior a la de 2C(I248T) tanto en ausencia como en presencia de poli(A). Sin embargo, la eficacia catalítica en presencia de poli(U) es 11 veces superior en 2C(I248T) que en 2C wt.

Figura 5.26 Determinación de los parámetros cinéticos Kd,app y kpol para 2C wt y 2C(I248T) en el ensayo de

actividad GTPasa. a) Representación de los valores kobs en función de concentraciones crecientes de GTP obtenidos con 2C wt en en ausencia de RNA o en presencia de poli(A) (120ng/µl) o poli(U) (120ng/µl). Los datos kobs se ajustan a una hipérbola en cada caso. b) Igual que en a) utilizando 2C(I248T); obsérvese las diferencias en las escalas de abscisas y ordenadas entre a) y b). Los procedimientos de la realización de los ensayos de actividad GTPasa con 2C se detallan en el apartado 4.28 de Materiales y Métodos. La representación gráfica así como la obtención de la ecuación de las distintas hipérbolas se realiza con el programa KaleidaGraph (Synergy Software).

Tabla 5.14 Valores de las constantes cinéticas de 2C y 2C(I248T) para el ensayo de actividad GTPasa.

ENZIMA Kd,app (µM) kpol (s-1) kpol/Kd,app (µM-1 x s-1)

2C wt 56±12 0,0006±0,0000 1,1 x 10-5 2C wt + poli(A) 176±12 0,0020±0,0001 0,9 x 10-5 2C wt + poli(U) 176±23 0,0020±0,0001 0,9 x 10-5 2C(I248T) 70±14 0,0004±0,0000 0,6 x 10-5 2C(I248T) + poli(A) 191±36 0,0007±0,0001 0,4 x 10-5 2C(I248T) + poli(U) 27±3 0,0030±0,0002 11 x 10-5

Valores de Kd,app y kpol para la actividad GTPasa en ausencia de RNA o presencia de poli(A) o poli(U) de las enzimas 2C y 2C(I248T) obtenidos a partir del análisis de las gráficas que se muestran en la Figura 5.26. Se muestra el valor de eficacia catalítica (Kcat) calculado como kpol/Kd,app.

5.4.6 Determinación de las constantes cinéticas K

y k

para el ensayo de

actividad ATPasa de las enzima 2C y 2C(I248T) en presencia de Mn

El ensayo estándar de actividad ATPasa y GTPasa (descritos en el apartado 5.4.2) se realiza en presencia de Mg2+ _{(apartado 4.28 de Materiales y Métodos). Para determinar si el} cambio I248T influye activamente en la unión al metal durante la fosforolisis, se ha estudiado la actividad ATPasa en presencia de Mn2+ _{y poli(A). La eficacia catalítica de 2C bajo estas} condiciones es 2 veces superior a la de 2C(I248T) (7,6 x 10-5 _µM-1 _s-1 _{y 3,5 x10}-5 _µM-1 _s-1_, respectivamente; Figura 5.27). Estos valores son menores, tanto para 2C como para 2C(I248T), que los obtenidos para el mismo ensayo en presencia de Mg2+ _{y poli(A) (ver Tabla 5.13) pero} se mantiene la misma relación entre ellos [la eficacia catalítica ATPasa de 2C wt en presencia de poli(A) es 2 veces la de 2C(I248T), tanto en presencia de Mg2+ como de Mn2+]. Así, la sustitución I248T no parece estar influyendo directamente en la interacción de 2C con el ion divalente.

Figura 5.27 Determinación de los parámetros cinéticos Kd,app y kpol para el ensayo de actividad ATPasa de 2C

en presencia de poli(A) utilizando Mn2+ _{como metal. a) Representación de los valores de k}

obs en función de concentraciones crecientes de ATP obtenidos con 2C wt en presencia de poli(A) (120ng/µl) y 1 mM Mn2+_{. Los datos} experimentales se ajustan a una hipérbola en cada caso. La linea discontinua representa, a modo de comparación, la hipérbola obtenida con 2C wt en presencia de poli(A) (120ng/µl) y Mg2+ _{mostrados en la Figura 5.25. b) Igual que} en a) utilizando 2C(I248T); obsérvese la diferencia en la escala de ordenadas entre a) y b). Los procedimientos para la realización de los ensayos de actividad ATPasa con 2C se detallan en el apartado 4.28 de Materiales y Métodos. La representación gráfica así como la obtención de la ecuación de las distintas hipérbolas se realiza con el programa

5.4.7 Inhibición de la actividad ATPasa de 2C y 2C(I248T) por ribavirina-5’-trifosfato

La ribavirina-5’-trifosfato (RTP) se puede incorporar durante la síntesis de RNA viral por la polimerasa de VFA como análogo de ATP o GTP (apartado 2.8.2.2.5 de Introducción). Dado que 2C tiene actividad ATPasa y GTPasa, y que la mutación I248T en 2C aparece durante tratamiento con R de pMT28-3D(3M), resultaba interesante investigar si RTP ejerce algún efecto inhibitorio en la actividad NTPasa de 2C y 2C(I248T).

Figura 5.28 Determinación de los parámetros cinéticos de inhibición de 2C wt por RTP. a) Representación de

los valores de kobs en función de concentraciones crecientes de ATP en ausencia ó en presencia de 250 µM ó 500 µM RTP. Los datos se ajustan a una hipérbola. Los procedimientos para calcular la actividad ATPasa de 2C wt se detallan en el apartado 4.28 de Materiales y Métodos. La representación gráfica así como la obtención de la ecuación de las distintas hipérbolas se realiza con el programa KaleidaGraph (Synergy Software). A la derecha se muestra el resultado de la cromatografía de un ensayo de actividad ATPasa en presencia de 0, 250 y 500 µM RTP. b) Representación de los datos de Kd,app obtenidos en a) en función de la concentración de RTP; la pendiente de la recta es Kd,app/Ki,app =273 µM. Cada una de los puntos representados se basa en al menos 3 conjuntos de datos independientes.

Para ello se han realizado ensayos de actividad ATPasa tal y como se describe en el apartado 4.28 de Materiales y métodos en presencia de 0, 250 y 500 µM RTP [Figura 5.28(a)]. Los valores de Kd,app para 2C wt en ausencia y presencia de 250 y 500 µM RTP son 112±17, 237±30 y 317±66 µM, respectivamente. Los correspondientes valores de kpol son 0,0020±0,0001; 0,0020±0,0001 y 0,0020±0,0002 s-1, respectivamente, e indican que RTP ejerce una acción inhibitoria sobre la actividad ATPasa. La inhibición es competitiva, ya que los valores de Kd,app aumentan mientras que kpol permanece constante. A partir de los datos obtenidos de Kd,app, se deduce que la Ki,app de RTP para la actividad ATPasa de 2C wt es 273 µM [Figura 5.28(b)]. Este valor es solamente 2,5 veces superior a Kd,app para ATP en el ensayo.

Figura 5.29 Determinación de los parámetros cinéticos de la inhibicón de 2C(I248T) por RTP. a)

Representación de los valores de kobs para 2C(I248T) en función de concentraciones crecientes de ATP en ausencia ó en presencia de 250 µM ó 500 µM RTP. Los datos experimentales se ajustan a una hipérbola en cada caso. Los procedimientos para calcular la actividad ATPasa con 2C(I248T) se detallan en el apartado 4.28 de Materiales y Métodos. La representación gráfica así como la obtención de la ecuación de las distintas hipérbolas se realiza con el

programa KaleidaGraph (Synergy Software). Cada una de las representaciones se basa en al menos 3 conjuntos de datos independientes. A la derecha se muestra el resultado de la cromatografía de un ensayo de actividad ATPasa en presencia de 0, 250 y 500 µM RTP. b) Representación de los datos de Kd,app obtenidos en a) en función de la concentración de RTP; la recta construida a partir de estos puntos tendría pendiente negativa, por lo que no se puede calcular Ki,app. Cada una de los puntos representados se basa en al menos 3 conjuntos de datos independientes.

Los mismos experimentos realizados con 2C(I248T) [Figura 5.29(a)] indican que RTP, en las concentraciones utilizadas, no inhibe la actividad ATPasa. Los valores de Kd,app en ausencia y presencia de RTP 250 y 500 µM RTP son 19±3, 16±4 y 15±4 µM, respectivamente. Los correspondientes valores para kpol son 0,00015±0,00001; 0,00013±0,00001 y 0,00013±0,00001 s-1_{, respectivamente. Por lo tanto, para 2C(I248T), no se puede deducir ningún} valor de Ki,app congruente a partir de los datos de Kd,app y kpol [Figura 5.29(b)].

5.4.8 Inhibición de la actividad ATPasa de 2C y 2C(I248T) por hidrocloruro de