4. Materiales y Métodos
5.3. Caracterización biológica de un mutante de VFA que presenta resistencia a
5.3.5. Frecuencia de mutación de una población derivada de pMT28-
A partir del RNA viral obtenido de I248Tp4 y R-I248Tp4, se ha realizado un análisis del espectro de mutantes de las poblaciones. Se obtienen frecuencias de mutación máximas de 6 x 10-4 y 24 x 10-4 s/nt para las poblaciones I248T y R-I248T, respectivamente, (5 y 20 mutaciones por genoma, respectivamente) (Tabla 5.9). El número de mutaciones encontrado en I248Tp4 no es significativamente diferente del encontrado en la población Wtp5 (t = 0,41 P>0,1). El número de mutaciones encontrado en R-I248Tp4 es mayor que en el espectro de mutantes de R-Wtp4, (24 x 10-4 frente a 19 x 10-3 s/nt) aunque la diferencia no es significativa (t = 1,61 P>0,05); en cambio, sí que es significativamente mayor que el número de mutaciones encontrado en R-3Mp4, la población con la polimerasa 3D con 3 mutaciones de resistencia (t = 4,49 P<0,005; Tabla 5.9). Por tanto, la frecuencia de mutación en un virus que codifica la proteína 2C(I248T) no es menor que el virus wt en presencia de R, indicando que la resistencia de la población R-I248T a R no es debida a una menor frecuencia de mutación.
Tabla 5.9 Frecuencia de mutación máxima de los espectros de mutantes de las poblaciones I248Tp4 y R-I248Tp4. Sin R Con R POBLACIÓNa FRECUENCIA DE MUTACIÓNb MUTACIONES POR GENOMAc FRECUENCIA DE MUTACIÓNb MUTACIONES POR GENOMAc I248T 6 x 10-4 5 24 x 10-4 20 3M 4 x 10-4 3 13 x 10-4 11 Wt 6 x 10-4 5 19 x 10-4 16
Para el análisis de los espectros de mutantes se han secuenciado 28455 nucleótidos en la población I248Tp4 y 29810 en la población R-I248Tp4. La zona secuenciada está comprendida entre los nucleótidos 6610 y 8020.
a “Wt” hace referencia a la población Wtp5, en el caso “Sin R”, y R-Wtp4, en el caso “Con R”. “3M” hace referencia a la población 3Mtp5, en el caso “Sin R”, y R-3Mtp4, en el caso “Con R”. “I248T” hace referencia a la población I248Tp4, en el caso “Sin R”, y R-I248Tp4, en el caso “Con R”.
b La frecuencia de mutación máxima está expresada como número de mutaciones diferentes encontradas con respecto al número total de nucleótidos secuenciados (apartado 4.17 de Materiales y Métodos).
c El número de mutaciones por genoma se calcula a partir de la frecuencia de mutacón estimando que el genoma de VFA tiene 8300 nucleótidos.
Los valores de frecuencia de mutación de las poblaciones Wtp5, 3Mp5, R-Wtp4 y R-3Mp4 son los mismos que se muestran en la Tabla 5.6, y se representan aquí a modo de comparación. Los protocolos de extracción de RNA viral total así como el método de clonaje del cDNA de cada una de las poblaciones se detallan en los apartado 4.5 y 4.10.2, respectivamente, de Materiales y Métodos.
5.3.5.1 Frecuencia de transiciones (C→U)+(G→A) y (U→C)+(A→G) en el espectro
de mutantes de las poblaciones derivadas de pMT28-2C(I248T)
Para comprobar si al igual que ocurre con la población 3M, hay una distribución alterada de los tipos de transiciones, se ha determinado la frecuencia de transición (C→U)+(G→A) y (U→C)+(A→G) de las poblaciones I248Tp4 y R-I248Tp4 (Tabla 5.10). En ambos casos se comprobó que la secuencia consenso de la región 2C no se había modificado durante los pases. La frecuencia de mutaciones (C→U)+(G→A) y (U→C)+(A→G) en la población I248Tp4 no tratada con R no difiere significativamente de las poblaciones Wtp5 (χ2 = 0,69 P>0,1) ni 3Mp5 (χ2 = 0,00 P>0,1). Por lo tanto, en ausencia de R, la población I248T no muestra diferencias ni en la frecuencia de mutación (ver Tabla 5.9) ni en el patrón de transiciones con respecto a las poblaciones no tratadas Wt y 3M.
La frecuencia de cambios (C→U)+(G→A) y (U→C)+(A→G) en el espectro de mutantes de R-I248Tp4 es significativamente diferente al de la población R-Wtp4 (χ2 = 10,7 P<0,001), pero no con respecto a la población R-3Mp4 (χ2 = 0,76 P>0,1; Tabla 5.10). Además, el patrón de transiciones en la población tratada con R, R-I248Tp4 tampoco es significativamente diferente al de la población I248Tp4 (χ2 = 0,08 P>0,1). Así, la proteína 2C con la substitución I248T de VFA parece afectar al tipo de incorporaciones incorrectas que se
producen en la población. Por lo tanto, las poblaciones derivadas de pMT28-2C(I248T) tratadas con R son resistentes a la extinción manteniendo un balance de las transiciones (C→U)+(G→A) y (U→C)+(A→G) similar al que ocurre en las poblaciones no tratadas con la droga.
Tabla 5.10 Frecuencia de las transiciones (C→U)+(G→A) y (U→C)+(A→G) en el espectro de mutantes de las poblaciones derivadas de pMT28-2C(I28T).
TRANSICIONES (C→U)+(G→A) (U→C)+(A→G) POBLACIÓN %a Frecuenciab %a Frecuenciab Sin R I248Tp4 37 2,2 x 10-4 50 3,0 x 10-4 Wtp5 22 1,3 x 10-4 78 4,7 x 10-4 3Mp5 27 0,9 x 10-4 55 2,2 x 10-4 Con R R-I248Tp4 46 11 x 10-4 54 13 x 10-4 R-Wtp4 80 15 x 10-4 20 3,8 x 10-4 R-3Mtp4 34 4,4 x 10-4 63 8,2 x 10-4
a Porcentaje de transiciones (C→U)+(G→A) y (U→C)+(A→G) en el espectro de mutantes de las poblaciones I248Tp4 y R-I248Tp4. El porcentaje de transiciones (C→U)+(G→A) y (U→C)+(A→G) está expresado con respecto al total de mutaciones (transiciones y transversiones) encontradas en los correspondientes espectros de mutantes estudiados. Las frecuencias de transiciones están basadas en el análisis de los espectros de mutantes estudiados en el apartado 5.3.5.
b Frecuencia de transiciones (C→U)+(G→A) y (U→C)+(A→G) calculada multiplicando el porcentaje de transiciones por la frecuencia de mutación de cada una de las poblaciones indicadas (Tabla 5.9).
Los valores de frecuencia de transiciones de las poblaciones Wtp5, 3Mp5, R-Wtp4 y R-3Mp4 son los mismos que se muestran en la Tabla 5.7, y se representan aquí a modo de comparación.
5.3.6 Fitness relativo debido a la mutación I248T en el contexto de pMT28-3D(3M)
Los resultados obtenidos en los apartados 5.3.3 y 5.3.5 indican que un virus con la mutación U5087C que codifica la substitución I248T en la proteína 2C no se extingue en presencia de R y además mantiene constante el patrón de transiciones (C→U)+(G→A) y (U→C)+(A→G). La mutación se origina en respuesta a un tratamiento con R del virus pMT28- 3D(3M) (apartado 5.3.1). Por tanto, resulta de interés saber cómo influye esta mutación en la resistencia a un tratamiento con la droga en el contexto genómico de pMT28-3D(3M).
Para ello se ha construido el plásmido pMT28-3D(4M). Se trata de un clon infeccioso que contiene la mutación U5087C en 2C en el contexto del genoma de pMT28-3D(3M). Se realizan ensayos de fitness coinfectando el virus pMT28-3D(4M) y el virus pMT28-3D(3M) en presencia y ausencia de 5000 µM R, tal y como se detalla anteriormente. En ausencia de R, el
virus pMT28-3D(4M) presenta una eficacia relativa 3 veces superior a pMT28-3D(3M), indicando que I248T favorece la replicación de un virus que codifica la polimerasa mutante 3D(3M). En presencia de R, pMT28-3D(4M) muestra un valor de fitness 5 veces superior a pMT28-3D(3M). Este valor es 2,5 veces superior al valor de eficacia biológica de pMT28- 3D(3M) con respecto a pMT28 en presencia de R [Figura 5.5(b)]. Ello indica, por tanto, que I248T juega un importante papel en la resistencia del virus pMT28-3D(3M) a R.