DETERMINACIÓN DE microRNAs EMPLEANDO BIO-RECEPTORES SELECTIVOS

A pesar de su enorme relevancia biológica en el diagnóstico, pronóstico y predicción de respuesta frente a tratamientos específicos [Tiberio, 2015], los inconvenientes asociados a la detección y cuantificación de miRNAs, comentados anteriormente, demandan metodologías adecuadas para su determinación sensible, selectiva y fiable.

Las proteínas virales desempeñan importantes funciones en mecanismos celulares interaccionando con moléculas de DNA y RNA de pequeño tamaño, con afinidad variable. Algunas de las más conocidas son las proteínas de unión a cadenas sencillas de DNA (SSB), la

proteína viral p21 de la remolacha amarilla [Berezovski, 2003], la proteína p19 de

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2010]. Entre ellas, la proteína p19 es una de las más estudiadas tanto desde el punto de vista estructural como funcional [Cheng, 2009], [Ye, 2003].

El RNA sencillo (ss-RNA) del genoma de los Tombusvirus codifica para una proteína de 19 kDa conocida como proteína p19 del virus de mancha anular de Carnation Italiano (CIRV p19), capaz de enlazar y secuestrar a siRNAs evitando su incorporación en el complejo proteico RISC [Vargason, 2003]. El mecanismo de funcionamiento de la p19 se basa en la captura de dobles cadenas de RNA (ds-RNA) con elevada especificidad independientemente de su secuencia, pero con afinidad muy dependiente del tamaño del homohíbrido de RNA y sin afinidad observada hacia otras especies genómicas como ss-RNA, rRNA, mRNA, ss-DNA y ds-DNA. El complejo p19-ds-RNA se forma como consecuencia de interacciones electrostáticas y enlaces por puente de hidrógeno formados entre las láminas β de la proteína p19 y los grupos fosfatos del ds-RNA, lo que demuestra que esta interacción resulta independiente de la secuencia del ds-RNA [Khan 2011], y que este sistema de reconocimiento pueda trasladarse a la detección de cualquier miRNA previamente hibridado con su sonda de RNA complementaria siempre que se mantengan los requerimientos de longitud del híbrido para el reconocimiento por la p19 [Degliangeli, 2014]. Desde el punto de vista estructural, la p19 existe disponible comercialmente como una proteína de fusión bifuncional con un dominio de unión a maltosa (MBD) en el extremo Nt y un dominio de unión a quitina (CBD) en el extremo Ct, los cuales pueden aprovecharse tanto para su inmovilización efectiva sobre

partículas magnéticas funcionalizadas con quitina [Jin, 2014] como para su marcaje

enzimático con un anticuerpo capaz de reconocer el dominio MBD. En relación a su afinidad frente a homohíbridos de RNA, ésta es máxima para híbridos de longitud comprendida entre 19 y 20 nts con extremos romos fosforilados en las terminaciones 5’ [Jin, 2010],ya que las interacciones que se producen entre los residuos de triptófano de la proteína y los grupos fosfatos de este tipo de homohíbridos favorecen la estabilización del dímero p19-ds-RNA

[Khan, 2011].

Diversos estudios realizados sobre su estructura demuestran que esta proteína actúa como una especie de “tenaza” o “pinza molecular” capaz de secuestrar homohíbridos de RNA por sus extremos, de un determinado tamaño, e independiente de su secuencia. De todas las proteínas virales involucradas en mecanismos de supresión de siRNAs, la p19 presenta la mayor afinidad hacia siRNAs con una longitud comprendida entre 20 y 22 nts (Kd ∼ 0.2 nM)

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que disminuye drásticamente para siRNA con secuencias de mayor o menor longitud

[Danielson, 2013].

En el proceso de biogénesis de los miRNAs, una vez que el pre-miRNA es procesado en el dúplex maduro, el grupo monofosfato del extremo 5’ de la sonda guía (miRNA maduro) enlaza con los dominios de la proteína Ago [López-Orozco, 2015], [Graves, 2012] para incorporarse al complejo proteico RISC. Esto demuestra que la proteína p19 no requiere ninguna etapa extra de modificación del miRNA diana para poder interaccionar con el dúplex que lo contiene, y que el único requisito es la presencia del grupo fosfato en el extremo 5’ del miRNA.

Estas propiedades únicas que ofrece la p19 para el reconocimiento de pequeños RNAs no codificantes se demuestran, entre muchos otros, en los trabajos de Nasheri y col. [Nasheri, 2011] y Fang y col. [Fang, 2006], en los que emplearon esta proteína para la detección de miRNAs mediante inmunoensayos y resonancia de plasmón superficial (SPR), respectivamente. Estas estrategias proporcionaron muy buenas sensibilidades sin realizar etapas previas de amplificación por PCR [Qavi, 2010], lo que reduce el tiempo y el coste del ensayo y simplifica considerablemente el procedimiento de análisis.

La elevada afinidad de esta proteína para la determinación de homohíbridos de RNA de determinada longitud, ofrece extraordinarias posibilidades para su empleo en el desarrollo de plataformas que permitan la determinación simultánea de diferentes miRNAs con sensibilidades similares tras su hibridación con sondas de RNA complementarias.

Así, se han desarrollado metodologías basadas en el empleo de la p19 que ofrecen características muy atractivas tanto para la determinación óptica como electroquímica de miRNAs, en ausencia de complejos procedimientos de pre-amplificación, marcaje y post- hibridación de los miRNAs diana, características que las hacen estrategias altamente competitivas, novedosas, y versátiles, aplicables a la determinación de cualquier miRNA, y fácilmente implementables en dispositivos POC. Sin embargo, es importante destacar que aunque este tipo de bio-receptores novedosos ha supuesto un importante avance para la determinación de miRNAs y otros RNAs de pequeño tamaño, un mayor conocimiento de los procesos de interacción proteína-ds-RNA, el desarrollo de nuevas técnicas de recombinación que mejoren la eficiencia en la expresión de este tipo de receptores, y la funcionalización de los mismos con todo tipo de marcajes adaptables al tipo de ensayo requerido en cada caso,

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resulta esencial para abrir nuevos horizontes en el diagnóstico de enfermedades aplicando estas estrategias tan prometedoras [Campuzano, 2016].

Otro ejemplo de receptores de afinidad relevantes cuyas propiedades pueden ser explotadas para la detección de miRNAs y otros marcadores de naturaleza genética, son los anticuerpos y las proteínas de dedo de zinc (ZNF), con elevada especificidad hacia heterohíbridos de DNA–RNA.

Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal S9.6 (Ab S9.6), generado in vitro en ratones usando el antígeno sintético ɸX174 DNA–RNA, presenta gran especificidad y afinidad hacia híbridos de DNA–RNA reconociendo epítopos de, aproximadamente, 6 pares de bases (bp)

[König, 2017]. A diferencia de la p19, Ab S9.6 no presenta ningún tipo de restricción en cuanto al tamaño del híbrido, por lo que puede emplearse para el análisis de cualquier miRNA y otros RNAs independientemente de su tamaño [Campuzano, 2017d_{]. Además, el empleo de Ab S9.6}

para la detección de RNAs implica la necesidad de llevar a cabo una etapa de hibridación previa entre la secuencia diana y su sonda complementaria de DNA, lo que introduce importantes ventajas frente al uso de la p19 como elemento de reconocimiento dada la mayor estabilidad del DNA en comparación con la del RNA [Degliangeli, 2014], debido principalmente a su estructura química y a la menor prevalencia de DNAsas en condiciones normales del laboratorio.

Así, al igual que la proteína p19, el anticuerpo S9.6 se presenta como una excelente alternativa para el análisis sensible, específico, sencillo y rápido de miRNAs y otros tipos de RNAs de relevancia en el campo clínico. Los biosensores basados en Ab S9.6 descritos hasta la fecha, demuestran en general mejor sensibilidad que los basados en el empleo de la p19, con la ventaja adicional de que los procesos de inmovilización y orientación de anticuerpos están más controlados y establecidos que los de las proteínas virales [Campuzano, 2017d_].

Las ZNF, por otro lado, enlazan híbridos homólogos de DNA (ds-DNA) [Kim, 2011],

[Noh, 2015], pero algunos tipos, como JAZ, ZNF346 y la proteína específica 1 (SP1) pueden reconocer también con gran afinidad híbridos DNA–RNA o RNA–RNA [Burge, 2014], [Iuchi, 2001],[Fang, 2017].

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Los complejos proteína-híbrido formados por la p19, el anticuerpo S9.6 y la proteína de dedo de zinc se esquematizan en la Figura 16.

Figura 16: Complejos de la proteína p19, el anticuerpo S9.6 y la proteína de dedo de zinc frente a homo- y hetero-híbridos de RNA.

Aunque desde el punto de vista de la sensibilidad analítica alcanzada, Ab S9.6 y ZNF proporcionan los mejores resultados, la p19 también presenta importantes ventajas derivadas de su afinidad restringida hacia híbridos de RNA de un determinado tamaño. Teniendo en cuenta que la unión de la p19 se produce fundamentalmente por interacciones con los extremos del homohíbrido de RNA, es de esperar que pequeñas modificaciones en esta parte del dúplex se traduzcan en una disminución de la afinidad de la proteína hacia el mismo. Un tipo de degradación que pueden sufrir los miRNAs es la que se conoce con el nombre de degradación de miRNAs dirigida por RNA diana (TDMD), que se basa en la presencia de sondas de mRNA con gran complementariedad frente a un miRNA determinado y que puede provocar la degradación del miRNA mediante mecanismos basados en la adición de nucleótidos al extremo 3’ del mismo, seguido del recorte del miRNA. Este proceso ocurre principalmente en los miRNAs de los mamíferos que, a diferencia de otros miRNAs, no están protegidos frente a la degradación con grupos 2’O-metilo en sus extremos 3’ [Haas, 2016]. En este sentido, las metodologías basadas en la proteína p19, aunque menos sensibles, son más restrictivas en cuanto a la interacción y captura del híbrido, y por ello, es de esperar que la afinidad frente a híbridos formados por el miRNA maduro funcional y su sonda exogéna de RNA complementaria disminuya considerablemente cuando el miRNA maduro ha sufrido algún proceso de degradación, lo que asegura que la p19 captura de manera única y fiable el miRNA con actividad funcional y con interés clínico para el diagnóstico y pronóstico de diversas neoplasias.

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En las Tablas 4 y 5 se resumen algunos de los trabajos más recientes descritos para la

determinación electroquímica de miRNAs empleando estos elementos de reconocimiento con elevada afinidad hacia híbridos particulares de RNA, como bio-receptores de captura y de detección, en muestras clínicas de distinta naturaleza. Es importante destacar que estas metodologías aúnan la elevada afinidad de estos bio-receptores hacía híbridos particulares de RNA con la selectividad de los procesos de hibridación.

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Tabla 4: Estrategias electroquímicas desarrolladas para la determinación de miRNAs basadas en el empleo de la proteína viral p19 como elemento de reconocimiento.

Electrodo Papel bio-receptor _{inmovilización}Tipo de Analito Técnica de _detección Muestra LD Referencia

GPE previamente

activado Captura

Inmovilización pasiva entre p19-ds-RNA y

GPE miRNA-21 DPV

RNAt de la línea celular

PBS1 1.6 pmol (10 µL muestra) [Kilic, 2013]

SPGNP Detección Interacción Au y sonda _SH-RNA miRNA-21, miRNA-32 y _miRNA-122 (Ru(NHSWV 3)63+)

([Fe(CN)6]3-/4-)

Muestras de suero 5 amol (30 µL muestra) [Labib, 2013]

SPCE-AuNPs _{(+ anti-MBP-HRP)}Detección Interacción Au y sonda _SH-RNA miRNA-21

Amperometría

(Eapp = –0.2 V vs.

Ag/AgCl)

(H2O2/HQ)

RNAt de células de

cáncer de mama 142 fM [Zouari, 2018a]

SPCE-AuNPs-DOTE-

DOTAP Detección

Interacción electrostática entre cargas negativas de RNA y cargas positivas

de liposomas catiónicos (DOPE y DOTAP) miRNA-124a miRNA-221 miRNA-21 DPV ([Fe(CN)6]3-/4-) ---- 5 fM [Ghazizadeh, 2018]

Abreviaturas utilizadas: Au: oro; AuNPs: nanopartículas de oro; DOPE: dioleoil fosfatidil etanolamina; DOTAP: 1, 2-dioleoyl-3-trimetilamonio-propano; DPV: voltamperometría diferencial de

impulsos; ds-RNA: RNA de doble cadena; GPE: electrodo de lápiz de grafito; HQ: hidroquinona; HRP: peroxidasa de rábano; LD: límite de detección; MBP: dominio de unión a maltosa; miRNA:

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Tabla 5: Estrategias electroquímicas desarrolladas para la determinación de miRNAs basadas en el empleo de Ab S9.6 y ZNF como elementos de reconocimiento.

Electrodo Bio-receptor/ _{Función inmovilización}Tipo de Analito Técnica de _detección Muestra LD Referencia

CP/RGO/GCE Ab S9.6/Detección

Enlace covalente entre

NH2-DNA y

CP/RGO/GCE mediante EDC/NHS

miRNA-29b-1 y

miRNA-141 SWV --- 5 fM [Tran, 2013]

SPAuE modificado con

RGO y o-MWCNT Ab S9.6-HRP/Detección

Enlace covalente entre

NH2-DNA y o-MWCNTs

mediante EDC/NHS

miRNA-29b-1 y

miRNA-141 (H2SWV O2/HQ) --- 10 fM [Tran, 2014]

GCE/AuNPs Ab S9.6-AP/Detección Interacción SH-DNA y _AuNPs miRNA-319a _{(p-nitrofenol)}DPV Semillas de arroz 0.4 fM [Wang, 2015b_]

SPCE Ab S9.6/Detección afinidad (Estrep-Interacción por

biotina) (Estrep-MBs) miRNA-21

Amperometría (Eapp = –0.2 V vs. Ag/AgCl) (H2O2/HQ) RNAt de células y tejidos frescos de

cáncer de mama 0.4 pM [Vargas, 2017]

Electrodo ITO

modificado con pSAM AP/DetecciónJAZ, ZNF346- DNA sobre pSAM/ITOInmovilización NH2- miRNA-21

Cronoculombimetría ((Ru(NH3)63+, HQ, TCEP) Muestras de suero contaminadas con miRNA-21 2 fM (buffer) 30 fM (suero 1:10) [Fang, 2017]

Abreviaturas utilizadas: Ab S9.6: anticuerpo S9.6; AP: fosfatasa alcalina; AuNPs: nanopartículas de oro; CP: polímero conductor; DPV: voltamperometría diferencial de impulsos; EDC: 1-etil-3-

(3-dimetilaminopropil) carbodiimida; Estrep: estreptavidina; GCE: electrodo vitrificado de carbono; HQ: hidroquinona; HRP: peroxidasa de rábano; ITO: óxido de indio y estaño; JAZ, ZNF346:

proteína de dedo de zinc; LD: límite de detección; miRNA: micro-RNA; o-MWCNTs: nanotubos de carbono de pared múltiple oxidados; NH2: grupo amino: NHS: N-hidroxisuccinimida; pSAM:

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En relación a las estrategias basadas en la proteína p19 como elemento de reconocimiento, Kilic y col. [Kilic, 2013] desarrollaron un biosensor electroquímico para la

determinación de miRNA-21 en líneas celulares, sobre electrodos de grafito tipo lápiz (GPE). En una primera etapa, se produce la hibridación del miRNA-21 con una sonda complementaria sintética de RNA en disolución, y a continuación, los híbridos de miRNA–RNA formados, son capturados por la p19, presente también en disolución. La detección de miRNA-21 se realiza sumergiendo el GPE, previamente activado, en la mezcla que contiene el complejo p19- miRNA–RNA produciéndose la inmovilización pasiva del mismo sobre la superficie electródica y monitorizándose la oxidación de los residuos de triptófano de la p19 a +0.80 V (vs. electrodo Ag/AgCl) mediante DPV. La aplicabilidad de este biosensor se demostró determinando el contenido endógeno del miRNA diana en muestras de RNAt extraído de la línea celular PBS1.

En el trabajo de Labib y col. [Labib, 2013] se propuso un biosensor basado en tres modalidades de detección y aplicable a la determinación de tres miRNAs de relevancia (miRNA-21, miRNA-32 y miRNA-122) en cáncer de colon, próstata e hígado, en muestras de suero. Esta plataforma biosensora proporcionó una excelente selectividad frente a secuencias de miRNAs diana con una única base desapareada en posición central y terminal y es capaz de discriminar entre miRNAs con distinto contenido de A/U y G/C. Las modalidades de detección consisten en procesos de hibridación entre el miRNA diana y su sonda de RNA complementaria correspondiente (H-SENS), la captura específica del híbrido de RNA por la proteína p19 funcionalizada con un tag de histidinas (His-Tag p19) (P-SENS), y el desplazamiento de la proteína viral en presencia de una concentración elevada de híbrido de RNA en disolución. En los tres casos la detección se realizó mediante SWV entre –0.4 y +0.8 V en presencia de K3[Fe(CN)6] y [Ru(NH3)6]Cl3. Los autores demostraron que la adición de la p19 amplifica significativamente la respuesta obtenida tras el simple proceso de hibridación permitiendo la detección ultrasensible de miRNAs, y que el desplazamiento de la p19 permite detectar cualquier miRNA sin necesidad de emplear sondas complementarias de RNA funcionalizadas. La combinación de estas tres modalidades, que proporcionó una triple confirmación para la detección fiable del miRNA objeto de estudio, se llevó a cabo sobre electrodos de oro serigrafiados y modificados con AuNPs (SPGNP) para la detección secuencial de miRNA-32 y miRNA-122, mediante la inmovilización de sondas de RNA tioladas y complementarias al miRNA-32, hibridación con el mismo y captura del híbrido inmovilizado

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por la p19, y desplazamiento de la proteína viral en presencia de elevadas concentraciones de híbridos de miRNA-122, obteniéndose un rango lineal operacional que abarca 11 órdenes de magnitud (10 aM–1 µM) y un LD de 90 moléculas de miRNA/30 µL de muestra.

Más recientemente, Zouari y col. [Zouari, 2018a_{] emplearon la proteína p19 como}

elemento detector en el desarrollo de biosensores amperométricos implementados sobre SPCEs modificados con AuNPs (SPCE-AuNPs) y SAMs de sondas de RNA tioladas complementarias al miRNA a determinar (miRNA-21). Tras la hibridación específica del miRNA diana sobre los transductores electroquímicos funcionalizados con la sonda complementaria de RNA, la proteína p19 reconoce los homohíbridos inmovilizados para, posteriormente, llevar a cabo su marcaje enzimático empleando un anticuerpo conjugado con HRP específico para el dominio MBP de la p19 empleada (anti-MBP-HRP), y realizando la transducción amperométrica en presencia del sistema H2O2/HQ. Con esta sencilla estrategia los autores alcanzan un LD de 142 fM para la detección de miRNA-21, y un rango lineal operacional comprendido entre 0.5–50 pM. Este trabajo destaca por el reducido tiempo de ensayo (60 minutos, una vez modificados los transductores electroquímicos con las sondas de RNA, y 8 horas para la obtención de la superficie RNA-SH-SPCE-AuNPs, frente a los 5 días que requiere la preparación de la superficie electródica empleando el protocolo de Labib y col. [Labib, 2013]), la excelente selectividad obtenida frente a secuencias de miRNA-21 con una única base desapareada, y la elevada estabilidad (2 meses) de la superficie electródica modificada sin pérdida significativa de la sensibilidad para la detección del miRNA diana, aspectos que resultan tremendamente atractivos para la aplicación de este tipo de dispositivos en determinaciones rutinarias. Finalmente, la aplicabilidad de la estrategia se confirmó determinando el contenido endógeno de miRNA-21 en tan solo 50 ng de RNAt extraído de células tumorigénicas (MCF-7) y no tumorigénicas epiteliales (MCF-10A) de mama.

Ghazizadeh y col. [Ghazizadeh, 2018] han propuesto recientemente un biosensor electroquímico basado en SPCE modificados con AuNPs, liposomas catiónicos 1,2-dioleoyl-3- trimetilamoniopropano y dioleoylfosfatidiletanolamina (DOTAP/DOPE) y la proteína p19 como elemento detector, para la determinación, mediante DPV, de miRNA-221, miRNA-124a y miRNA-21. La estrategia consistió en la formación de diversas estructuras de doble cadena de RNA empleando sondas quimera “stem” y lineales para evaluar la función de reconocimiento de la proteína p19 hacia los distintos híbridos formados. La falta de

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accesibilidad que muestra la p19 hacia los híbridos formados por el miRNA correspondiente y su sonda quimera complementaria, produce una disminución en la respuesta electroquímica del sensor, mientras que la adición de un híbrido de RNA al sistema que la p19 reconoce de manera apropiada, desencadena el aumento de la señal medida. Tras la modificación de los SPCE modificados con AuNPs y DOTAP/DOPE, se lleva a cabo la inmovilización de una mezcla de sondas tipo “stem” y lineales complementarias a miRNA-221 y miRNA-124a, respectivamente, que hibridaban en una etapa posterior con el miRNA correspondiente. A continuación, la superficie transductora modificada se incubaba con la proteína p19, y finalmente, se añadía al sistema el híbrido miRNA-21–RNA formado, llevándose a cabo la monitorización de los cambios en la señal amperométrica obtenida mediante DPV entre –0.4 y +0.4 V como consecuencia de la accesibilidad de la p19 hacia los distintos híbridos de RNA presentes. El sensor desarrollado, con un LD de 5 fM y un rango lineal comprendido entre 500 aM–1.0 nM, se aplicó a la determinación simultánea de los tres miRNAs propuestos sobre el mismo dispositivo, en 2 horas y con buena selectividad.

En cuanto a las estrategias electroquímicas para la detección de miRNAs empleando anticuerpos selectivos a heterohíbridos de DNA–RNA, todos los trabajos descritos hasta la fecha se basan en este receptor como elemento de detección.

Tran y colaboradores desarrollaron en el año 2013 y 2014 dos biosensores electroquímicos para la detección de miRNA-29b-1 y miRNA-141, importantes biomarcadores asociados a enfermedades cardiovasculares y cáncer de próstata, respectivamente, alcanzándose LDs en el rango de fM [Tran, 2013],[Tran, 2014].

El biosensor desarrollado en el primer trabajo [Tran, 2013] consistía en el empleo de electrodos de carbono vitrificado modificados con óxido de grafeno reducido (RGO) y un polímero conductor formado mediante la electropolimerización del ácido 3-(5-hidroxi-1,4- dioxo-1,4-dihidronaftaleno-2(3)-il) propanoico (JUGA) y 5-hidroxi-1,4-naftoquinona (JUG) (JUGA-co-JUG). Las sondas de DNA específicas a cada miRNA funcionalizadas con grupos –NH2 se inmovilizaron covalentemente sobre la superficie transductora mediante “grafting” empleando EDC/NHS y, tras la hibridación con el miRNA, los heterohíbridos formados eran reconocidos por el anticuerpo S9.6 específico formándose el complejo Ab/DNA–RNA. Mediante SWV se monitorizaba la disminución de la señal obtenida como consecuencia del