2. INTRODUCCIÓN
2.3. BIOSENSORES ELECTROQUÍMICOS PARA DETERMINACIÓN INDIVIDUAL
2.3.1. DETERMINACIÓN INDIVIDUAL DE BIOMARCADORES PROTEICOS
2.3.1.4. RELEVANCIA CLÍNICA Y DETERMINACIÓN DE HER-2
Otra familia de proteínas que forma parte del grupo de receptores tirosina quinasa son los receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, ErbB), que han evolucionado en la especie Homo sapiens hasta contar con cuatro receptores y numerosos ligandos: ErbB1 (HER-1), ErbB2 (HER-2), ErbB3 (HER-3) y ErbB4 (HER-4) [Sánchez, 2010].
Los receptores de la familia ErbB/HER (Figura 11) regulan y median diversas rutas de
señalización molecular, desde el exterior al interior de las células, involucradas en el desarrollo embrionario, desarrollo adulto, y proliferación, migración, diferenciación y reorganización estructural de las células, evidenciando su indudable importancia biológica
[Carreón, 2012].
Figura 11: Principales receptores de la familia ErbB/HER.
El cáncer de mama, al igual que la mayoría de las neoplasias, es una enfermedad compleja y heterogénea, causada como consecuencia de numeroas alteraciones genéticas y epigenéticas (expresión de proto-oncogenes y supresores tumorales, desestabilización cromosómica, alteración en los mecanismos de reparación genética y reactivación de la
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telomerasa, etc.), que alteran los procesos celulares y promueven la adquisición de fenotipos malignos por parte de las células [Reis-Filho, 2008], [Rodenhiser, 2006].
Dada la heterogeneidad que caracteriza a esta enfermedad y la falta de fiabilidad de las metodologías empleadas para la clasificación de este tipo de neoplasias, se están realizando esfuerzos considerables para la identificación y validación de biomarcadores de pronóstico que permitan estratificar la enfermedad tanto desde el punto de vista biológico como histopatológico [Chan, 2013], y la toma de decisiones terapéuticas eficientes y personalizadas, adaptadas a las necesidades particulares de cada paciente [Dai, 2015].
Algunos biomarcadores de gran utilidad para el diagnóstico y pronóstico del cáncer de mama, accesibles a través de “biopsias líquidas”, que permiten monitorizar el transcurso de la enfermedad de una forma más fiable y que se corresponde realmente con el estado actual de la neoplasia, incluyen CTCs, cfDNA [Du, 2013], y diversos tipos de biomarcadores característicos del tejido tumoral, como los receptores hormonales de estrógeno y progesterona (ER y PR), el HER-2, la proteína Ki67 y el plasminógeno activador de urokinasa y su inhibidor (uPA/PAI-1), entre otros. Recientemente, ASCO ha actualizado las recomendaciones para el uso de marcadores tumorales como biomoléculas de actuación en la prevención, cribado, tratamiento, seguimiento y supervisión del cáncer de mama, seleccionando para tal fin los biomarcadores: CA15-3, CA27.29, CEA, ER, PR, HER-2, uPA, PAI- 1, p53, catepsina D, ciclina E y nestina, [Kabel, 2017] y de los que, por el momento, el análisis de ER, PR y HER-2, capaces de predecir los beneficios de terapias hormonales y anti-HER-2, respectivamente, es de carácter preceptivo y obligatorio en pacientes diagnosticadas con esta neoplasia.
Los estrógenos, de gran importancia durante el desarrollo de la glándula mamaria y tratamiento de cáncer de mama (ya que aproximadamente el 70 % de los cánceres de mama son ERα-positivos), enlazan y activan ER, que presenta dos isoformas principales (-α y -β) localizables tanto en la membrana como en el citoplasma celular, siendo la isoforma -α la que presenta validez clínica debido a su elevada expresión en pacientes con este tipo de neoplasia
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El PR pertenece a la superfamilia de los receptores nucleares, y como su nombre indica, se encuentra principalmente en el núcleo celular [Cremoux, 2003]. La expresión de PR es altamente dependiente de la presencia de ER en el microambiente tumoral [Weigel, 2010]
ya que controla la actividad de ERα, hecho de gran importancia en procesos asociados con el pronóstico e intervención terapeútica en relación a la evolución y tratamiento de este tipo de cáncer [Mohammed, 2015].
Así, ambos receptores hormonales se consideran biomarcadores predictivos y de pronóstico de gran relevancia cuyos niveles de expresión pueden predecir la respuesta de pacientes sometidas a tratamientos endocrinos, e informan acerca del pronóstico de la enfermedad [Duffy, 2017].
HER-2 (también conocido como HER-2/neu o c-erbB2) es el receptor con actividad tirosina quinasa más dominante en cáncer de mama, amplificado en, aproximadamente, el 20 % de los casos, y con elevados niveles de expresión también en neoplasia de ovario y de estómago.
Los subtipos de cáncer de mama que muestran amplificación del gen HER-2 resultan más sensibles a la administración de fármacos anticancerígenos y presentan mayor resistencia a tratamientos basados en terapias hormonales [Plavetic, 2012].
Los protocolos convencionales que se emplean para el tratamiento de cáncer de mama dependen del estado de ER, PR y HER-2. Así, mientras que la presencia de estos receptores sugiere una mayor efectividad del tratamiento, la ausencia de éstos, característica del subtipo molecular de cáncer de mama TNBC, requiere tratamientos terapéuticos más tóxicos que los que se aplican en otros subtipos moleculares.
Desde el punto de vista molecular, y dependiendo de la expresión de ER, PR y HER-2, el cáncer de mama se clasifica en 4 subtipos moleculares [Hon, 2016], esquematizados en la
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Figura 12: Clasificación de los principales subtipos moleculares de cáncer de mama dependiendo de la expresión de ER, PR y HER-2.
El gen HER-2 también está implicado en el desarrollo de neoplasias epiteliales de colon, ovario, próstata, páncreas y pulmón, y amplificado en el 20–30 % de los carcinomas invasivos ductales, prediciendo un mal pronóstico clínico y cortas etapas de DFS y OS
[Freudenberg, 2009].
Entre las metodologías para la detección de HER-2 a nivel proteico destaca la técnica IHC en muestras de tejido congelado, lo que limita la evaluación de HER-2 en la práctica diaria fuera de los entornos de los laboratorios de investigación [Niño, 2007]. Además, estudios recientes han demostrado que empleando estas metodologías, el 20 % de los pacientes calificados inicialmente como HER-2- desarrollan con el tiempo un cáncer HER-2+ recurrente y que la determinación de la fracción soluble extracelular de este receptor (sHER-2) en suero, que puede desprenderse de la membrana celular y ser liberado a la circulación como consecuencia de diversas metaloproteasas, mejoraría significativamente la fiabilidad del diagnóstico y por tanto la eficiencia del tratamiento aplicado, estableciéndose para ello un valor de corte de 15 ng mL-1 [Shi, 2017a]. Asimismo, diversos estudios ponen de manifiesto la
relación existente entre el nivel sérico de sHER-2, la carga tumoral, un peor pronóstico en cáncer de mama metastásico y la predicción de la respuesta del paciente frente a tratamientos de quimioterapia neoadyuvantes [Lee, 2016].
Como se ha comentado a lo largo de la introducción de esta Tesis Doctoral, la detección precoz de cualquier tipo de neoplasia resulta determinante en el pronóstico de la enfermedad y en la calidad de vida y supervivencia del paciente. Además de los métodos convencionales de análisis para biomarcadores de distinto nivel molecular relacionados con
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el desarrollo del cáncer de mama, las exploraciones mamarias (o mamografías) están diseñadas con el fin de monitorizar mujeres sanas que en principio no presentan ningún síntoma asociado con el desarrollo de la neoplasia [Heywang-Köbrunner, 2011], así como para el diagnóstico de la enfermedad en casos sospechosos en los que se observa algún síntoma o signo específico de la misma. Las técnicas de exploración mamaria convencionales se basan en procedimientos de rayos X, con importantes desventajas asociadas a la limitada sensibilidad, al elevado riesgo de falsos positivos y a la exposición a radiaciones [Joy, 2005], lo que ha desencadenado un interés sustancial por parte de la comunidad internacional de oncología en la implementación de estrategias o metodologías alternativas para determinaciones rutinarias mínimamente invasivas para el diagnóstico de esta enfermedad.
En este sentido y, como consecuencia de las ventajas que ofrecen estos dispositivos electroquímicos, se han desarrollado hasta la fecha un gran número de estrategias biosensoras para la determinación electroquímica de biomarcadores asociados al cáncer de mama en todo tipo de muestras clínicas y especímenes biológicos [Campuzano, 2017c].
Considerando la aplicación clínica real de tales dispositivos un requerimiento esencial para su futura implementación en la rutina hospitalaria, la Tabla 3, recoge algunos ejemplos de
93 Tabla 3: Biosensores electroquímicos para la determinación de HER-2.
Transductor Soporte inmovilización Tipo de Ensayo Marcador Técnica de detección LD Muestra Referencia
SPCE ProtA-MBs Interacción ProtA-región Fc del Ab Sándwich Estrep-AP (naftilfosfato) DPV 6 ng mL-1 Suero humano [Al-Khafaji, 2012]
GCE Polipirrol-NHS@GCE entre las lisinas de Enlace covalente
Ab y NHS-polipirrol Directo --- EIS 100 células mL
-1 Células [Seven, 2013]
AuE PEG @Fe3O4NPs
Enlace covalente entre Ab tiolado y
los grupos de maleimida de las
NPs
Directo --- ([Fe(CN)DPV 6]3-/4-) 0.995 pg mL-1 Suero humano [Emami, 2014]
SPCE HOOC-SPCE Enlace covalente entre Nb y SPCE Sándwich Nb-HRP
Amperometría
(Eapp = –0.28 V vs.
Ag/AgCl)
(H2O2/HQ)
1 µg mL-1 Lisados de células humanas
suplementadas [Patris, 2014]
SPCE AuNPS@SPCE Inmovilización del Ab por adsorción Sándwich Estrep-AP (3-IP/AgASLWV +) 4.4 ng mL-1 Suero humano
suplementado [Marques, 2014]
SPCE AuNPs@SPCE Aff por quimisorción Inmovilización de Directo --- EIS 6 ng mL-1 Suero humano [Ravalli, 2015]
CILE AuNPs@MWCNT-CILE
Enlace covalente entre Ab y AuNPs coloidales con grupos carboxílicos
94 Tabla 3 (continuación): Biosensores electroquímicos para la determinación de HER-2.
Transductor Soporte inmovilización Tipo de Ensayo Marcador Técnica de detección LD Muestra Referencia
Au-IDE MPA@IDE entre aptámero HER-Enlace covalente
2 y MPA Directo --- nFIS 0.2 ng mL
-1 Suero humano [Qureshi, 2015]
SPCE Estrep-MBs ProtA-MBs
Interacción por afinidad (Estrep-
biotina) Afinidad ProtA-región
Fc del anticuerpo
Sándwich Estrep-AP (naftilfosfato) DPV Aff/Aff: 1.8 ng mL
-1
Aff/Ab: 2.6 ng mL-1
Ab/Aff: 3.4 ng mL-1 Suero humano [Ilkhani, 2016]
AuE PEG@SAM@AuE Coinmovilización aptámero- PEG@SAM@AuE vía alcanotiol Directo MB ([Fe(CN)CV 6]3-/4-) 10
-12 M Suero humano [Salimian, 2017]
Abreviaturas utilizadas: Ab: anticuerpo; Aff: affibody; Ag–Ab: complejo antígeno-anticuerpo; ASLWV: voltamperometría lineal con redisolución aniónica; AP: fosfatasa alcalina; AuE: electrodo
de oro; AuNPs: nanoparticulas de oro; CILE: electrodo de carbono de líquido iónico; CV: voltamperometría cíclica; DPV: voltamperometría diferencial de impulsos; Eapp: potencial aplicado; EIS:
espectroscopía de impedancia electroquímica; Estrep: estreptavidina; Fc: fragmento cristalizable del anticuerpo; GCE: electrodo vitrificado de carbono; HER-2: receptor 2 del factor de
crecimiento epidérmico humano; HQ: hidroquinona; HRP: peroxidasa de rábano; IDE: microelectrodos interdigitados; LD: límite de detección; MB: azul de metileno; MBs: partículas magnéticas; MPA: ácido 3-mercaptopropiónico; MWCNT: nanotubos de carbono de pared múltiple; Nb: nanobody; nFIS: espectroscopía de impedancia no faradaica; NHS: N-hidroxisuccinimida; PEG:
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Los trabajos desarrollados por Marques y col. y Emami y col., empleaban nanomateriales como modificadores electródicos para la inmovilización del Ab selectivo al dominio extracelular de HER-2 (HER-2 ECD), y su análisis en muestras de suero.
Marques et al. propusieron un inmunosensor electroquímico basado en una estrategia tipo sándwich en el que el conjunto HER-2 ECD-Ab detección (pre-incubado durante tan solo 5 minutos) era reconocido por un anticuerpo de captura previamente inmovilizado sobre un SPCE funcionalizado con AuNPs. La interacción Ag–Ab se monitorizaba por voltamperometría de barrido lineal (LSV), en presencia del conjugado Estrep-AP y 3-indoxil-fosfato (3-IP) e iones de plata, como marcador y sustrato enzimático, respectivamente, obteniendo un LD tres veces inferior al valor de corte establecido para HER-2 ECD en suero (15 ng mL-1). La metodología se aplicó a la determinación directa de HER-2 en muestras de suero suplementadas con la diana molecular de interés [Marques, 2014].
El trabajo de Emami et al., se basaba en la modificación de nanopartículas de óxido de hierro (Fe3O4 NPs) con polietilenglicol (PEG) y maleimida, para enlazar covalentemente anticuerpos anti-HER-2 tiolados. El conjunto Ab-Fe3O4-NPs se inmovilizaba sobre electrodos de oro funcionalizados con AuNPs@MPA@Cys a partir de la interacción entre los grupos de maleimida libres y los grupos tiol de Cys. Tras el reconocimiento de HER-2 se monitorizaba la disminución de la señal de Fe(CN)63-/4- mediante voltamperometría diferencial de impulsos (DPV), como consecuencia del mayor bloqueo de la superficie del transductor en presencia de elevadas concentraciones de HER-2, que dificulta la transferencia electrónica entre el electrodo y la disolución. El inmunosensor desarrollado se aplicó al análisis de HER-2 en muestras de suero de pacientes con cáncer de mama en distintos estadios de la enfermedad validando los resultados obtenidos con la metodología ELISA [Emami, 2014].
Las excelentes propiedades que ofrecen las MBs también se han explotado para la detección de HER-2. Por ejemplo, Ilkhani et al., compararon tres immunoensayos electroquímicos tipo sándwich, empleando como elementos de captura y detección anticuerpos y affibodies (elementos sintéticos que imitan las funciones de los anticuerpos), Estrep-MBs y ProtA-MBs, y SPCEs para realizar la transducción electroquímica mediante DPV. Los resultados presentados demostraron que el formato basado en el empleo de affibodies biotinilados como elementos de captura y detección, sobre Estrep-MBs, proporcionaba la mayor sensibilidad. La aplicación de este formato a la determinación de HER-2 en muestras
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de suero suplementadas con el antígeno objetivo a distintos niveles de concentración
[Ilkhani, 2016], confirmó la utilidad analítica de los affibodies, caracterizados por su pequeño tamaño, robustez y alta estabilidad, cuya estructura combina una hidrofobicidad bien definida y una región extendida con funciones de reconocimiento molecular, como bio- receptores prometedores en el diseño de inmunosensores electroquímicos [Justino, 2015].
Además de biosensores de afinidad basados en receptores proteicos para la determinación electroquímica de HER-2 en muestras de suero y células (tanto enteras como lisadas), también se encuentran en bibliografía diversos trabajos para la determinación de este biomarcador empleando aptámeros disponibles comercialmente y modificados con diversas terminaciones (–SH, –NH2) para su correcta inmovilización sobre la superficie de transductores electroquímicos, monitorizando la extensión de la reacción de reconocimiento aptámero-proteína diana a través de las variaciones de la señal electroquímica de un indicador redox soluble, donde la transferencia electrónica puede ser acelerada, retardada o impedida, dependiendo del proceso de reconocimiento que tiene lugar.
Recientemente, Salimian y col. [Salimian, 2017] han desarrollado un biosensor electrocatalítico con una sensibilidad del orden de pM para el análisis de HER-2 inmovilizando aptámeros tiolados sobre transductores de oro previamente modificados con monocapas autoensambladas de polietilenglicol (PEG@SAM@AuE), empleando azul de metileno (MB) como indicador redox y CV. La aplicabilidad exitosa de esta metodología al análisis de muestras de suero al 1 % se atribuye tanto a la minimización de las posibles adsorciones inespecíficas por parte de PEG@SAM como a la amplificación de la señal del MB, que cataliza la reducción del par redox empleado Fe(CN)63-/4-.
Como se muestra en la Tabla 3, existen una gran variedad de estrategias
electroquímicas para la determinación de HER-2 basadas en todo tipo de técnicas de detección y superficies transductoras modificadas con materiales de escala micro- y nanométrica y/o monocapas autoensambladas, que favorecen tanto la minimización de las adsorciones inespecíficas como la inmovilización y orientación de los elementos de reconocimiento, que comprenden desde anticuerpos convencionales a biomoléculas proteicas más novedosas, tanto naturales (nanobodies) como sintéticas (affibodies), y secuencias sintéticas de oligonucleótidos (aptámeros). Estos antecedentes demuestran una vez más, la enorme versatilidad que ofrecen los biosensores electroquímicos para el
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desarrollo de estrategias analíticas sencillas, con una sensibilidad y selectividad apropiadas para la detección de pequeñas variaciones en la expresión de biomarcadores proteicos en muestras de elevada complejidad (tejidos, células enteras y lisadas, y suero), y cuyo nivel de corte establecido para discriminar entre pacientes diagnosticadas con cáncer de mama y mujeres sanas, que se encuentra en un nivel de ng mL-1, es perfectamente detectable mediante estas herramientas biosensoras empleando protocolos sencillos y rápidos.