DIAGNÓSTICO DE RESISTENCIA ANTIHELMÍNTICA

El método más confiable para detectar la resistencia a los antihelmínticos es el test in vivo conocido como “eficacia controlada”, el cual compara el número de

nematodos adultos obtenidos a la necropsia en animales tratados y controles. Por los altos costos requeridos, laboriosidad y tiempo demandado, este método se encuentra prácticamente restringido a trabajos muy específicos de investigación, limitando seriamente su aplicación en situaciones de campo. Así mismo, los test in vitro actualmente disponibles, basados en la motilidad de las larvas o en la eclosión de huevos, presentan aún inconsistencias en la interpretación de los resultados y requieren del mantenimiento de cepas de referencia susceptibles y resistentes, condicionando por el momento su uso. Por lo expuesto anteriormente, hasta el presente el método más utilizado en todo el mundo para detectar resistencia de los nematodos ha sido el test de reducción de conteo de huevos (TRCH), el cual compara los conteos de huevos antes y luego del tratamiento (Anziani y Fiel, 2004).

3.11.1. Métodos in vitro

Los métodos de laboratorio in vitro ofrecen ventajas y desventajas con respecto a los métodos in vivo. Las técnicas in vitro requieren de una considerable capacitación de los técnicos que efectúan esta metodología. Por otra parte, requieren que se trabaje con parasitosis monoespecíficas a los efectos de no dificultar la interpretación de los resultados, lo que hace de por sí mucho más complejo la implementación de estos métodos para el diagnóstico de resistencia en el campo. Además, se requiere del mantenimiento en laboratorio de una cepa susceptible y una resistente; en la práctica, la mayoría de las técnicas in vitro se llevan a cabo sólo para investigación. Por lo general son menos costosas que las técnicas in vivo, ya que no requieren del mantenimiento y alimentación de animales para la realización de las pruebas (Cutullé et al., 2016). A continuación se describen algunas de ellas:

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 Eclosión de huevos, técnica desarrolada para la detección de resistencia a los benzimidazoles: consiste en incubar huevos no desarrollados de nematodos en concentraciones seriadas de benzimidazoles por un tiempo prefijado y luego determinar la proporción que falla a la embriogénesis y/o eclosión. Para todos los métodos el porcentaje de huevos que desarrollan y/o eclosionan se corrige en base a la mortalidad natural en los controles no tratados y los datos se someten a análisis estadísticos para estimar la concentración logarítmica de la droga que previene el 50% de eclosión de huevos. El cultivo de las larvas hasta el tercer estadío permite la identificación del género parasitario que sobrevive. La principal desventaja de ésta prueba como rutina diagnóstica es el requerimiento de huevos no desarrollados. Esto es porque los benzimidazoles sólo actúan sobre el huevo en la primera parte del desarrollo; cuando la embriogénesis ocurre, los huevos se vuelven menos susceptibles a éste grupo de antihelmínticos y se pueden obtener resultados erróneos. La prueba de eclosión de huevos se utiliza actualmente como método discriminante de resistencia a campo para los benzimidazoles. Presenta dificultades en la interpretación de resultados cuando están involucradas infecciones mixtas y requiere materia fecal recién recolectada y conservada. El test es rápido, con resultados que pueden obtener en 1-3 días si la muestra inicial es adecuada en cantidad de huevos, y es simple a pesar de que requiere precisión técnica (Márquez, 2003).

 Eclosión de los huevos, técnica desarrollada para la detección de resistencia al levamisol: el test marca la diferencia entre cepas resistentes y susceptibles evaluando la proporción de recuperación de la eclosión que ocasionan distintas concentraciones de levamisol en larvas no eclosionadas. Se requiere de un periodo de incubación variable, dependiendo de las especies a analizar, para que los huevos desarrollen hasta el estadío pre-eclosión y estén completamente embrionados antes de agregar las diluciones de droga (Dobson et al., 1996).

 Parálisis larval: el principio de esta prueba se basa en determinar el porcentaje de parálisis de L3 después de haber sido expuestas 24 horas a diluciones seriadas de antihelmínticos. El test requiere de cepas susceptibles para ser testeadas en paralelo con la cepa sospechada

49 resistente; de esta forma se realizan comparaciones y se llega a un resultado. La prueba tiene la gran ventaja de utilizar L3 que son fácilmente obtenidas de coprocultivos. Si bien es un método relativamente fácil de llevar a cabo, presenta una serie de desventajas: ocurre una dosis- respuesta atípica, por lo que altas concentraciones de levamisol son menos efectivas para inmovilizar a las larvas que las bajas concentraciones. Es una prueba subjetiva en juzgar si la larva está inmovilizada o no, y el ensayo no puede ser preservado para ser cuantificado más tarde (Cutullé et al., 2016).

 Unión a la tubulina: este ensayo está basado en la diferente unión de los benzimidazoles a la tubulina obtenida de nematodos susceptibles y resistentes. En este ensayo se produce un extracto crudo de tubulina de parásitos adultos, larvas infectivas o huevos que son incubados con benzimidazol. Los extractos de tubulina de parásitos resistentes unen menos droga que los susceptibles lo cual es medido con un espectrofotómetro. Como desventaja se consideran el tiempo requerido para llevar a cabo la prueba, la utilización de material radioactivo y el hecho de considerar un solo sitio de acción cuando la resistencia está determinada poligenéticamente (Cutullé et al., 2016).

 Prueba de desarrollo larval: en esta prueba los huevos de nematodos se incuban hasta el tercer estadío larval en una placa multipocillos que contiene medio nutritivo para el desarrollo de los huevos y distintas concentraciones de antihelmínticos; existiendo además un pocillo control que contiene solamente medio nutritivo. La ventaja de esta técnica es poder evaluar distintos grupos de antihelmínticos en forma simultánea: benzimidazol, levamisol, combinación de benzimidazol y levamisol y avermectinas/milbemicinas. Las desventajas son que requiere un cuidadoso monitoreo de la placa que se incuba hasta la terminación de la prueba y requiere de huevos libres de desechos orgánicos por lo que el aislamiento de los huevos es uno de los puntos más críticos de la prueba (Márquez, 2003).

 Otras técnicas: la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una prueba altamente sensible que utilizan pequeñas cantidades de ADN para detectar bajas frecuencias de genes resistentes en poblaciones

50 susceptibles de parásitos. El uso de esta tecnología permitirá un diagnóstico precoz, un mejor monitoreo de la resistencia antihelmíntica y la aplicación de mejores medidas de manejo para combinar con el uso de antihelmínticos eficaces (Cutullé et al., 2016)

3.11.2. Métodos in vivo

 Test de reducción de conteos de huevos (TRCH): compara los valores de huevos por gramo de materia fecal antes y después del tratamiento. Se asocia la presencia de resistencia antihelmíntica cuando la reducción entre ambos valores del conteo resultan inferiores al 90% y en forma complementaria, este test requiere del cultivo de larvas en las muestras pre y post tratamiento para determinar la participación relativa de cada género parasitario. En rumiantes, los resultados del test deben ser considerados sólo una estimación de la eficacia antihelmíntica debido a que la postura de huevos por los nematodos no siempre guarda una estrecha correlación con la carga parasitaria (Suárez, 1994). En este contexto, el test podría mostrar mayor eficacia con géneros que tienen un alto potencial biótico y/o con buena correlación entre el número de huevos y el de nematodos como por ejemplo Haemonchus, pero podría ser menor cuando se considera al género Ostertagia. Otras de las limitantes del test es su baja sensibilidad, ya que sólo permite detectar resistencia cuando la frecuencia de genes resistentes en una población excede el 25% y ya se observan fallas clínicas al tratamiento (Martín et al., 1989; Sangster, 2002). Russo et al. (2000), sostiene el concepto de que la técnica de conteo de huevos por gramo de materia fecal es un método diagnóstico coproparasitológico valioso en la medida que éste no sea analizado aisladamente, siendo una herramienta de rutina a escala individual o de rodeo en el diagnóstico del grado de infección, siempre que se lo asocie a otros parámetros, antecedentes epidemiológicos y de manejo, coprocultivos e infestación de la pastura.Debido a que el TRCH estima los efectos del tratamiento sobre la postura de huevos por los nematodos adultos, el período de espera para la toma de muestras luego del tratamiento debería adaptarse al grupo químico utilizado para evitar la posibilidad de errores en su interpretación. Así, por ejemplo, estudios

51 posteriores a las primeras recomendaciones sobre el TRCH en bovinos realizados en nuestro país, muestran que en terneros inoculados con un aislamiento de Cooperia pectinata y tratados con moxidectina, las reducciones del conteo de huevos podrían ser consideradas como susceptibles o resistentes de acuerdo al día en que se toma la muestra post tratamiento (Tabla 2).

También en terneros inoculados con este mismo aislamiento y posteriormente tratados con ivermectina, se observaron valores generalmente superiores del recuento de huevos cuando las determinaciones se realizaron en el día 20 comparadas con las correspondientes al día 12 luego del tratamiento. De este modo y cuando se utilicen lactonas macrocíclicas, las evaluaciones post tratamiento deberían demorarse preferentemente hasta los días 18 a 20 para evitar la posibilidad de falsos negativos. Estas observaciones se deben a la inhibición temporaria de la oviposición producida durante las primeras dos semanas post tratamiento con avermectinas, la cual se restablecerá parcialmente luego de este período (Anziani y Fiel, 2004).

Por el contrario, cuando se emplean antiparasitarios en base a levamisoles, debe considerarse que estas drogas normalmente no actúan contra larvas hipobióticas y que incluso puede presentar actividad incompleta contra otros estadíos inmaduros de ciertos nematodos, aun cuando se trate de cepas susceptibles. De este modo la utilización de

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