2.3.5.3-DIAGNÓSTICO LABORATORIAL O DE CONFIRMACIÓN

Directo o etiológico:

Se basa en la observación de diferentes formas parasitarias en los tejidos de los animales afectados. Para ello se han descrito diversas técnicas:

-Observación directa: consiste en la visualización de quistes de B. besnoiti sobre el propio ganado. Estos quistes parasitarios pueden ser observados macroscópicamente en forma de pequeños puntos blanquecinos y en número muy variable en la conjuntiva esclerótica especialmente, pero también en la mucosa del tracto respiratorio superior y de la región vulvar/vaginal en las hembras. Este método es muy específico, sin embargo hay que tener en cuenta que los quistes se desarrollan a las 6-7 semanas PI, por lo que se trata de un diagnóstico de la besnoitiosis bovina en fase crónica.

-Examen microscópico: el análisis puede realizarse en un frotis de sangre, en un rapado o en una biopsia.

En el primer caso, se basa en la observación de los taquizoítos libres en sangre mediante la tinción de Giemsa. Su presencia en el torrente circulatorio es muy corta, de 1 a 10 días tras la infección, por lo que este diagnóstico se centra en la fase aguda de la enfermedad.

En el caso del raspado, el método consiste en realizar un raspado de aquellas zonas de la dermis o de la mucosa afectadas con sospecha de presencia de quistes tisulares. La muestra obtenida se coloca en un portaobjetos con un cubre y se pueden observar al microscopio los bradizoítos resultantes de la ruptura mecánica de los quistes.

Por último, mediante la biopsia de piel podemos observar, directamente en fresco (mediante placas de compresión) o por medio de técnicas histológicas, los quistes tisulares de B. besnoiti presentes en la dermis y subcutis de aquellos animales con esclerodermia. Esta técnica ha sido descrita en la bibliografía como un método rápido, económico y de elección para la confirmación de la besnoitiosis bovina (Sannusi, 1991). Además de mostrar los quistes de B. besnoiti, si se realiza un estudio histológico del tejido adyacente, este técnica permite valorar también la existencia de posibles

lesiones que suelen acompañar a los quistes como los infiltrados inflamatorios o granulomas.

Tanto el examen macroscópico como microscópico, al estar basados en la observación directa del parásito, presentan la ventaja de ser métodos de diagnóstico de la enfermedad muy específicos. Sin embargo, ambas técnicas muestran el inconveniente de no poder detectar los caso s subclínicos de la enfermedad.

-Diagnóstico molecular: el método de PCR cuantitativa descrito por Cortes (Cortes et al., 2007a) y adaptado posteriormente por Schares (Schares et al., 2011) permite la detección de ADN de B. besnoiti en muestras de piel y mucosa vaginal en aquellos animales afectados de forma crónica. Esta prueba se basa en la amplificación del fragmento de ARN ribosómico incluido en la región del ITS-1 (Internal Transcribed Spacer-1), previamente caracterizado por Ellis y colaboradores (Ellis et al., 2000). Se trata de un método altamente sensible y específico para la detección de la infección por B. besnoiti que no presenta reacciones cruzadas con otras especies de protozoos estrechamente emparentadas (Schares et al., 2011).

Según Schares y cols., la PCR cuantitativa descrita en su artículo es capaz de detectar ADN de B. besnoiti en muestras de piel y mucosa entre los días 1-3 tras el comienzo de la fase aguda febril, lo que implica un diagnóstico muy temprano de la infección (Schares et al., 2013).

Del mismo modo, varios autores apuntan que esta técnica podría resultar muy interesante para la detección de los taquizoítos circulantes presentes en la sangre durante los primeros días de la infección, lo que sería de gran utilidad para lograr un diagnóstico fiable y precoz de los casos agudos de besnoitiosis bovina (Alzieu et al., 2011; Álvarez-García et al., 2013).

Indirecto:

El diagnóstico indirecto está basado en la detección de anticuerpos séricos frente a la infección por B. besnoiti. Según Schares y cols., este tipo de diagnóstico es válido a partir de los 7-8 días tras la fase de infección aguda febril, por lo que se trata de una herramienta diagnóstica menos precoz que la PCR cuantitativa descrita anteriormente (Schares et al., 2013).

En la actualidad existen varias técnicas serológicas disponibles para la detección de la infección:

-Inmunofluorescencia indirecta (IFI): la técnica consiste en una reacción

específica entre los anticuerpos séricos del animal y los antígenos de B. besnoiti previamente fijados en un soporte sólido. Esta reacción se

evidencia por medio de un segundo anticuerpo marcado con un fluorocromo o una enzima cromógena capaz de unirse a los anticuerpos primarios.

Los primeros test de inmunofluorescencia descritos para el diagnóstico de la besnoitiosis bovina fueron desarrollados en Israel (Neuman, 1972), siguiendo los procedimientos utilizados por Goldman para el diagnóstico de Toxoplasma (Goldman & Carver, 1962).

Como aparece detallado anteriormente en el apartado de estudios epidemiológicos previos, la técnica de IFI ha sido empleada en múltiples ocasiones con el objetivo de realizar diferentes estudios de prevalencia (Goldman & Pipano, 1983; Janitschke et al., 1984; Shkap et al., 1984). En lo que respecta a nuestro laboratorio, la técnica de inmunofluorescencia empleada se puso a punto siguiendo el protocolo descrito por Álvarez-García y cols. para la detección de la infección por N.caninum (Álvarez-García et al., 2002). En un estudio seroepidemiológico previo realizado por nuestro equipo se vio que el punto de corte que permitía obtener los mejores resultados era el 1/100, mostrando una sensibilidad del 100% y una especificidad del 99,38% (IC95%: 86,58-99,97). Al aumentar el punto de corte se observaba un aumento de la especificidad, y por tanto un menor riesgo de falso s positivos, pero se detectaba en consecuencia una disminución en la sensibilidad (Zacarias, 2009). Este mismo hecho fue observado en un trabajo publicado poco después por Schares y colaboradores (Schares et al., 2010).

-Enzimoinmunoensayo (ELISA): el fundamento de esta técnica consiste en evidenciar la reacción antígeno-anticuerpo en el suero de los animales infectados por medio de una enzima que transforma un substrato en un producto cuantificable mediante espectrofotometría.

Al igual que en el caso anterior, las primeras descripciones del diagnóstico de la besnoitiosis bovina mediante el test de ELISA se sucedieron en Sudáfrica e Israel (Janitschke et al., 1984; Shkap et al., 1984). En ambos países, la técnica de ELISA presentaba similares especificidades en comparación con la IFI. Respecto a la sensibilidad, Janitschke observó en sus encuestas una mayor sensibilidad diagnóstica mediante la prueba de IFI y Shkap, contrariamente, mediante el test de ELISA. Más recientemente, Zacarias detalló en su trabajo que la IFI demuestra mayor sensibilidad para la detección de la besnoitiosis bovina que el ELISA, aunque la diferencia era escasa. Además, en ese artículo también se especifica que la concordancia obtenida entre ambas pruebas para el punto de corte de IFI 1/200 fue excelente, con un coeficiente kappa (k) de 0,89±0,02 (Zacarias, 2009). Cortes y cols. evaluaron en 2006 un test de ELISA para Besnoitia basado en la utilización de un antígeno somático soluble, previamente descrito para N. caninum (Gottstein et al., 1999). La sensibilidad obtenida fue del 87,0% y la especificidad varió del 96,4 al 98% (Cortes et al., 2006d). El propio autor propone también en su trabajo el empleo combinado de la técnica de ELISA para la realización de estudios de tipo cribado y la técnica de Western Blot para una confirmación diagnóstica más acertada de los casos individuales de besnoitiosis bovina.

Respecto al test de ELISA desarrollado por Fernández y cols. para el estudio de un brote en el centro de la península ibérica, dicha técnica se basó en el uso de antígeno soluble de B. besnoiti, y la sensibilidad y especificidad obtenidas alcanzaron el 100% (Fernández-García et al., 2009).

-Western Blot (WB): consiste en la detección mediante electroforesis de un patrón de bandas de proteínas específico frente a la infección por B. besnoiti. En el WB puesto a punto por Cortes y cols. se describe un patrón de bandas típico de besnoitiosis bovina compuesto por tres áreas antigénicas principales: área I (de los 12 a los 20 kDa), área II (entre 23 y 38 kDa) y área III (entre 60 y 90 kDa). A partir de ese patrón, se estableció el estándar necesario para determinar el diagnóstico de la infección. El criterio establecido fue un mínimo de cuatro bandas para el área I, cuatro para el área II y otras cuatro para el área III. El análisis de WB demostró una

sensibilidad del 91,3% y una especificidad entre el 94,6 y 100% (Cortes et al., 2006d).

Haciendo uso de la técnica de WB, Fernández -García y cols. llevaron a cabo en 2009 un estudio con el objetivo de identificar los antígenos

inmunodominantes específicos de los taquizoítos y los bradizoítos de B. besnoiti, lo que podría resultar de utilidad para el desarrollo de futuras

vacunas y nuevas herramientas diagnósticas que permitan diferenciar entre la infección aguda y crónica. En el citado trabajo se caracterizaron más de 28 antígenos en taquizoíto y 30 en el caso del bradizoíto. Para los taquizoítos, el reconocimiento de bandas fue idéntico en los sueros de animales asintomáticos o con signos clínicos de besnoitiosis bovina. Sin embargo, el número de antígenos de bradizoíto reconocido por los sueros de animales con signos fue mayor que el de los asintomáticos, tal vez debido a una exposición más prolongada al parásito (Fernández -García et al., 2009). En la misma línea, Schares y colaboradores caracterizaron 10 antígenos de taquizoíto y otros 10 de bradizoíto en sueros de animales infectados. En su estudio proponen un patrón mínimo de cuatro bandas de entre los 10 antígenos de taquizoíto y bradizoíto seleccionados para considerar un animal como positivo. Esta técnica mostró una especificidad del 100% y una sensibilidad del 90%, además de presentar una concordancia casi perfecta con la prueba de IFI detallada en el mismo trabajo (Schares et al., 2010). -Test de aglutinación directa (DAT): esta técnica se basa en la formación de un coágulo de aglutinación entre los anticuerpos presentes en los sueros de los animales infectados y una suspensión de antígeno junto con otras partículas preparada previamente que favorecen la fijación de este enlace. En 2011, Waap y cols. desarrollaron el único test de aglutinación directa descrito para el diagnóstico de la infección por B. besnoti. Considerando el punto de corte 1/160, el DAT mostró un grado de concordancia casi perfecto con la técnica de IFI (k=0,97), registrando una sensibilidad del 97,2% y una especificidad del 99,3% (Waap et al., 2011).

Una de las principales limitaciones del diagnóstico serológico es la dificultad para detectar la fase aguda y subaguda de la enfermedad, ya que, en ese

momento de la infección, los animales no han tenido tiempo suficiente para desarrollar anticuerpos frente a B. besnoiti. No obstante, este tipo de técnicas presentan la gran ventaja de poder identificar animales seropositivos con infección subclínica, que en el caso de la besnoitiosis bovina son la mayoría, además de resultar muy interesantes para la realización de estudios de evolución temporal de la seroprevalencia o de controles serológicos rutinarios de los rebaños.

En resumen, teniendo en cuenta un estudio inter-laboratorial llevado a cabo recientemente en el que se han comparado las diferentes opciones de pruebas serológicas para el diagnóstico de la besnoitiosis bovina disponibles en Europa, se recomienda el uso de la técnica de ELISA para la realización de estudios epidemiológicos, y el WB, que demostró unos valores de sensibilidad y especificidad más elevados, como método de confirmación o para el caso de animales de gran valor (García-Lunar et al., 2013).