RT-PCR Cuantitativa
7.2. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados obtenidos en esta revisión, mostraron que la mayoría de las mutaciones se generan en el gen rdxA, además, existe una gran variedad de alteraciones en los genes
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asociadas a la resistencia al metronidazol. Se observó que las mutaciones cambio de marco que resultan en la truncación de la proteína y las mutaciones de sentido erróneo fueron las más frecuentes en el estudio de la resistencia. Para analizar las secuencias de las cepas sensibles y resistentes al antibiótico, se experimentó inactivando los genes, insertando los fragmentos amplificados en vectores, para luego ser secuenciados y analizados, haciendo comparaciones de las secuencias de genes resistentes con los que eran sensibles y con las cepas control. Las alteraciones que más se presentaron en el gen rdxA fueron V68A, T118A, K90R, 73stop y R131K y en el gen frxA fueron I44F, S43A, A16T, N124S, F72S y G73S, cuyas CMIs oscilan entre 12- 256 ug/dL para rdxA, 12.5 ug/dL y 64-256 ug/dL para frxA, la relación entre la concentración mínima inhibitoria y la alteración del gen no se tomó en cuenta en la mayoría de los estudios, se encontró que el nivel de resistencia moderado al metronidazol es el que mas se presenta en estas alteraciones.
En el estudio de Kim et al., la cepa 313 con una CMI 32 ug/dL y sustitución de aminoácido D62Y en el gen frxA, generó resistencia al metronidazol sin estar acompañada de una alteración en otro gen, esto, demostró que la presencia de alteraciones solo en el gen frxA
confiere resistencia al metronidazol. La causa de la resistencia no implica necesariamente la alteración del gen, incluso, en ausencia de un rdxA funcional, una cepa de Helicobacter pylori puede ser sensible al metronidazol, como se mostró en los estudios reportados por 5 artículos (Goodwin et al., 1998, Tankovic et al., 2000, Solca et al., 2000, Kim et al., 2009, Han et al., 2006), se pueden encontrar genes intactos en algunas cepas resistentes al antibiótico sugiriendo que existen mecanismos de resistencia adicionales involucrados en esta resistencia.
En el estudio de Kwon et al., de la inactivación del gen fdxB, se determinó las CMIs de todas las cepas mutantes, la CMI para la cepa ha la que fue inactivado el gen fdxB incremento a 32 ug/mL en 6 cepas y a 128 ug/mL en una cepa. Las CMIs de las 7 cepas sensibles al metronidazol con inactivación doble de rdxA-fdxB aumentaron a 64 ug/mL para 6 cepas y a 128 ug/mL para una cepa, lo que confirma que la inactivación del gen frxB esta involucrada con la resistencia al metronidazol, la sola inactivación de este gen en cepas sensibles no muestra incrementos grandes en la CMI, mientras que al estar acompañada de una alteración en el gen rdxA, la concentración incrementa mucho mas que solo con mutaciones en el gen fdxB. Al inactivar a FdxA, FldA, OorD, PorD se observó que era letal para la bacteria, esto hace pensar, que son esenciales para la bacteria, lo que dificulta estudiar el papel de estas proteínas en la resistencia al metronidazol, se conoce hasta el momento que la actividad de la piruvato flavodoxina oxidorrecutasa es reemplazada por la
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piruvato-formato liasa, pero no se encontró si el resto de proteínas puede ser substituida por otra.
Las técnicas de biología molecular utilizadas para la investigación de la resistencia al antibiótico fueron la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa reversa (RT-PCR), reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa reversa cuantitativa (RT-PCR cuantitativa) y amplificación aleatoria de DNA polimórfico (RAPD). La técnica más empleada en los estudios fue la PCR, considerando que es una técnica en la que se pueden emplear muestras de fluidos gástricos y no gástricos, muestras embebidas en parafina, sin purificación previa, utiliza pequeñas cantidades de DNA, lo que es una ventaja debido al difícil aislamiento de la bacteria, el investigador selecciona las regiones especificas para la amplificación, determinando si realmente en esa región se presentó alteraciones en el gen. La RT-PCR en esta investigación se utilizó para verificar si realmente la pérdida de la función de la proteína RdxA que genera resistencia es por mutación o no del gen que la codifica, esta técnica nos proporciona información funcional de la proteína, al analizar el mRNA, la RT-PCR cuantitativa, evaluó la intensidad óptica de los productos de la PCR, encontrando que la intensidad decrece en cepas resistentes. En otros estudios, se utilizó RAPD y se encontró que esta técnica no es útil en el estudio de las mutaciones, amplifica regiones del DNA al azar, lo que implica, que si dentro de las regiones amplificadas no se encuentra la alteración del gen, posiblemente en las regiones que no amplificó si se podría encontrar la mutación. Las tres últimas técnicas no son utilizadas, porque son mucho más dispendiosas, requiere la síntesis cDNA y condiciones específicas para obtener el mRNA de Helicobacter pylori.
La secuenciación es el método ideal para conocer las alteraciones en un oligonucleótido del DNA de la bacteria, proporciona información del orden y de los nucleótidos que forman parte del gen.
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8. CONCLUSIONES
1. No todas las alteraciones presentes en los genes rdxA y frxA en Helicobacter pylori
generan resistencia al metronidazol, algunas cepas resistentes al antibiótico permanecen con genes intactos, lo que implica que la resistencia se asocia a otros elementos genéticos.
2. La alta resistencia de Helicobacter pylori al metronidazol está relacionada con la CMI, existe una gran variedad de las alteraciones genéticas generadas en los genes rdxA y
frxA.
3. La técnica más útil y mayor empleada para la detección de alteraciones en los genes de
Helicobacter pylori es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
4. Dada la alta resistencia encontrada al metronidazol, se sugiere no utilizar este antibiótico en las terapias de erradicación de la bacteria.
5. No se pudo hacer un análisis global de las mutaciones de todos los genes asociados a la resistencia al metronidazol porque no hay suficiente información disponible, debido a que no se han realizado estudios sobre el tema.
6. Hasta el momento no se han realizado estudios experimentales y revisiones sistemáticas de las alteraciones de los genes fdxA, fdxB, fldA, oorD y PorD asociados con la resistencia al metronidazol.
7. No se han reportado estudios de comparación de técnicas de biología molecular en el estudio de las alteraciones de los genes en cepas resistentes al metronidazol, para obtener las características operativas y determinar cuál sería más útil.
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9. RECOMENDACIONES
Se recomienda realizar investigaciones experimentales de las alteraciones de los genes diferentes al rdxA y frxA asociados a la resistencia al metronidazol, así como la comparación de las diferentes técnicas de biología molecular para la detección de dichas alteraciones, para tener en cuenta las características operativas de cada método.
También se recomienda realizar el estudio de la resistencia asociadas a las alteraciones de los genes rdxA, frxA, fdxA, fdxB, fldA, oorD y PorD presentes en cepas colombianas de
Helicobacter pylori.
Adicionalmente se recomienda, realizar trabajos in Silico para predecir las secuencias de DNA de las cepas de Helicobacter pylori o las secuencias de proteínas en caso de tener la secuencia del gen.
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10. REFERENCIAS
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