DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Los resultados y la información obtenida demostraron un monitoreo de las variables críticas para un proceso bajo control, lo cual proporciona un alto grado de seguridad

a la validación realizada donde se producirán constantemente las mismas características obteniendo resultados confiables y reproducibles.

Los resultados demuestran que la técnica de filtración por membrana para evaluar los filtros de acetato y nitrocelulosa evaluada es precisa, reproducible al tener en cuenta que se realizó diferentes días y es repetible ya que se realizó por el mismo analista y con el mismo equipo.

Se identificaron los factores que influyen en la validez de la prueba y los pasos a seguir para el buen desarrollo de la validación con la recopilación de la información que se realizó.

La calibración y el mantenimiento de los equipos es un paso importante dentro de la metodología de validación; los equipos utilizados durante las diferentes pruebas realizadas se encontraban funcionando correctamente y dentro de los rangos esperados, por lo tanto se debe contar con un cronograma de mantenimiento preventivo vigente. (Ver Tabla Nº 8)

Los resultados de la prueba organoléptica mostraron que los medios de cultivo cumplen con las especificaciones de color, textura y aspecto según las casas comerciales y la USP 29, indicando su calidad para la obtención de resultados en la metodología realizada. (Ver Tabla Nº 9)

La prueba de promoción de crecimiento demostró que los medios de cultivo Fluido de Tioglicolato y Digerido Caseína-Soja contienen los nutrientes necesarios para el desarrollo y crecimiento de los microorganismos evaluados. (Ver tabla Nº 10)

El crecimiento de los microorganismos contaminantes en los medios de cultivo líquidos en los 3 ensayos realizados se evaluó en un tiempo de 2 y 5 días de incubación, en los medios de cultivo líquidos se observó turbidez en menor tiempo de lo esperado, por lo cual se determinó para cada microorganismo su curva de crecimiento en ambos medios, los resultados se obtuvieron por medo del método espectrofotométrico.

Después de evaluar los medios de cultivo inoculados mediante espectrofotometría se evidenció el crecimiento de los microorganismos contaminantes mediante turbidez evidenciada por la disminución del porcentaje de tramitancia durante el tiempo evaluado.

Los microorganismos crecieron en ambos medios de cultivo debido a que estos no contienen sustancias inhibitorias y poseen sustancias nutritivas que ayudan al crecimiento de bacterias, hongos y levaduras.

El medio Fluido de Tioglicolato es utilizado principalmente para microorganismos anaerobios, como Clostridium sporogenes, por su contenido de sustancias reductoras y su alta viscosidad, también crecen microorganismos aerobios y microaerofílicos al poseer componentes como dextrosa, peptona de caseína y extracto de levadura, los cuales proveen los factores de crecimiento necesarios para la replicación. (ZIMBRO y POWER, 2003) Por lo cual para el trabajo realizado los resultados de tramitancia obtenidos reflejan una disminución aproximada del 25% – 30% a las 24 horas de inoculación. Sin embargo, Clostridium sporogenes fue el microorganismo que presentó mayor porcentaje de tramitancia en este tiempo (ver Tabla Nº 13) es decir su crecimiento fue menor.

Esto se atribuye a que en cada tiempo evaluado al tomar la muestra se pudo introducir oxígeno atmosférico o aumentó el oxígeno por alguna agitación del frasco y éste es un microorganismo anaerobio que necesita total ausencia de oxígeno.

En el medio Digerido Caseína-Soja se presentó crecimiento de bacterias aerobias, hongos y levaduras, debido a que este medio de cultivo es altamente nutritivo por la combinación de peptonas de caseína y soya y se encuentra exento de sustancias inhibidoras lo cual soporta el crecimiento de gran variedad de microorganismos exigentes y no exigentes. (ZIMBRO y POWER, 2003)

A las 24 horas de evaluación de los microorganismos en el medio Digerido Caseína- Soja se obtuvo una disminución entre el 13% y 18% de tramitancia comparado con el medio Fluido de Tioglicolato para Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Aspergillus niger y Staphylococcus aureus. (Ver Tablas Nº 16, 18, 22 y 24). Bacillus subtilis presentó menor crecimiento a las 24 horas pero durante todo el tiempo

evaluado se observó mayor crecimiento y por lo tanto disminución del porcentaje de tramitancia. (Ver Tabla Nº 20)

Durante las 100 horas evaluadas se encontró que Clostridium sporogenes no creció en el medio Digerido Caseína-Soja debido a que este microorganismo es anaerobio y el medio no posee las condiciones ni sustancias reductoras apropiadas para su crecimiento. La falta de crecimiento se determinó al obtener por espectrofotometría valores altos de % de tramitancia y valores cercanos al valor de tramitancia del tiempo inicial (ver Tabla Nº 14), esto demuestra que no se presentó turbidez en el medio de cultivo, a diferencia de los otros microorganismos evaluados en el mismo medio.

El tiempo requerido para el crecimiento evidenciado por turbidez puede ser considerado como la suma de dos etapas, una fase donde los microorganismos se preparan para crecer, y el tiempo de generación requerido para un bajo nivel de crecimiento donde éstos son visibles a la visión humana, la concentración de los microorganismos es aproximadamente 107 UFC/mL. (MOLDENHAUER y SUTTON, 2004)

Los resultados mostraron que en las primeras horas después de la inoculación de los microorganismos en los dos medios de cultivo los valores del porcentaje de tramitancia disminuyeron en menor proporción con relación a las demás horas evaluadas. Esto determina que los microorganismos tuvieron una fase de adaptación durante las primeras seis horas aproximadamente, donde los microorganismos empezaron a tomar los nutrientes del medio para su posterior replicación. Para luego presentarse un crecimiento determinado por valores de % tramitancia muy bajos y la presencia de turbidez.

La linealidad fue determinada mediante el software Validation Manager, evaluando los datos de % de tramitancia obtenidos para cada microorganismo contaminante en los medios de cultivo líquidos durante 100 horas evaluadas.

Para cada microorganismo inoculado en los medios de cultivo se determinó la regresión lineal y el coeficiente de correlación, observándose que hay una relación directa entre las dos variables, en este caso a medida que aumenta el tiempo el

microorganismo produce biomasa presentandose turbidez lo que provoca la disminución del porcentaje de tramitancia del medio de cultivo.

A partir de cada regresión lineal calculada se obtuvo la ecuación de la recta la cual puede ser utilizada para estimar porcentajes de tramitancia en valores de tiempo no evaluados, demostrándose así una relación directamente proporcional entre las dos variables estimadas.

El coeficiente de correlación calculado para cada curva evaluada fue superior a 0.9 valor que para crecimiento y cuantificación microbiano es óptimo, siendo los menores valores 0,92 y 0,93 obtenidos para Bacillus subtilis en los medios Fluido de tioglicolato y Digerido caseína-soja respectivamente (ver figuras Nº 29 y 30). Estos coeficientes demuestran resultados para la regresión lineal donde existe un alto grado de asociación y una relación directa entre las dos variables (tiempo vs. crecimiento microbiano), obteniendo así un modelo lineal.

Para verificar que el recuento de los microorganismos no fuera mayor a 100 UFC/mL se sembraron en los medios sólidos agar Casoy y agar HC según lo indica la USP 29. Esto se evidenció en los tres días de ensayo para la prueba de promoción de crecimiento en los resultados obtenidos para Candida albicans, Aspergillus niger y Clostridium sporogenes los cuales tuvieron recuentos entre 20 y 100 UFC/mL, y para los recuentos de Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa en el segundo y tercer ensayo. (Ver Tabla Nº 11)

Los resultados obtenidos en los recuentos de Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa se relacionan con la disminución del porcentaje de tramitancia durante el tiempo evaluado, especialmente durante las primeras 24 horas en el medio Fluido de Tioglicolato.

Por otro lado la prueba de esterilidad de los medios de cultivo se realizó a cada lote de esterilización y se incubaron los medios durante 14 días, tiempo durante el cual se evidenciaron resultados satisfactorios ya que no existió crecimiento de ningún microorganismo contaminante en los medios de cultivo utilizados en la técnica de filtración por membrana, estos medios de cultivo se dejaron como controles negativos de la prueba de esterilidad.

Gracias a los resultados derivados de las pruebas preliminares se continuó con los ensayos de la técnica de filtración por membrana para la prueba de esterilidad, ya que de haber observado resultados no satisfactorios la prueba sería no válida. (USP 29, 2006)

Los resultados obtenidos a partir de los cinco días de montaje de la técnica de filtración por membrana fueron satisfactorios ya que en los ensayos realizados con los filtros de acetato y nitrato de celulosa evaluados se observó crecimiento de los microorganismos inoculados en los diluyentes, los cuales fueron filtrados y la membrana sembrada en los medios Fluido Tioglicolato y Digerido Caseína Soja, verificando de esta forma la retención microbiana en los filtros por la presencia de crecimiento microbiano en los medio de cultivo.

Los seis microorganismos utilizados en la prueba crecieron satisfactoriamente en los medios líquidos (ver Tablas Nº 27, 28, 29, 30 y 31), es decir fueron retenidos en los filtros de acetato y nitrato de celulosa y utilizaron los nutrientes de los medios de cultivo para promover su crecimiento. En el montaje 2 correspondiente al 21 de abril de 2007 se observó menor turbidez en los medios Fluido de Tioglicolato que poseían los filtros de membrana contaminados con Clostridium sporogenes. El medio que contenía la membrana de nitrato de celulosa se sembró en agar Casoy después de los 14 días de incubación, en éste medio de cultivo sólido se evidenció crecimiento al cual se le realizó coloración de Gram observando la presencia de bacilos Gram positivos.

En todos los ensayos realizados por la técnica filtración por membrana los medios Digerido Caseína-Soja adicionados con los filtros de acetato y nitrato de celulosa contaminados con Clostridium sporogenes no presentaron turbidez, esto se debe a que éste medio de cultivo es adecuado para el crecimiento de hongos, levaduras y bacterias aerobias (ZIMBRO y POWER, 2003), y no para bacterias anaerobias como es el caso de Clostridium sporogenes.

Estos resultados se relacionan con la prueba de promoción de crecimiento apoyada por espectrofotometría, donde el medio Digerido Caseína-Soja inoculado con

Clostridium sporogenes no presentó disminución del % de tramitancia, esto quiere decir que el microorganismo no creció.

Al comparar los dos filtros de membrana acetato y nitrato de celulosa con un tamaño de poro de 0,45µm se observó que éstos retienen microorganismos contaminantes, de esta forma se puede asegurar su uso en las pruebas de esterilidad con resultados óptimos y confiables.

A partir de cada filtración se adicionó el fluido filtrado en los medios de cultivo obteniendo resultados satisfactorios (ver Tablas Nº 32, 33 y 34) al no presentarse turbidez durante los 14 días de incubación. Esto demuestra que el diluyente después de ser filtrado no contiene microorganismos contaminantes debido a que éstos quedaron retenidos en los filtros de acetato y nitrato de celulosa empleados en la prueba de esterilidad dejando así el líquido filtrado estéril.

Para evitar falsos positivos y posibles repeticiones es importante tener en cuenta el buen manejo del equipo de filtración ya que al desarrollarse la prueba de esterilidad en un sistema abierto existe mayor riesgo de contaminación cruzada, por esto es crucial el ajuste del equipo, la ubicación del filtro de membrana dentro del embudo y la mínima manipulación, que pueden generar falsos positivos y posibles repeticiones.

En el estudio realizado se evaluó el control negativo de cada montaje de la técnica de filtración por membrana donde solamente se filtró el diluyente estéril y se incubaron los medios de cultivo con los filtros de membrana. Estos resultados fueron satisfactorios al no presentar turbidez en los medios, lo que demuestra que no se presentaron falsos positivos que afecten la validez de la prueba.

Durante el tiempo empleado en cada ensayo de la técnica de filtración de membrana se realizó el control ambiental y de personal, los resultados obtenidos cumplen (ver Tablas Nº 25 y 26) según los límites microbianos manejados por AQM Ltda. (Ver Tablas Nº 6 y 7) Estos resultados aseguran que las condiciones de trabajo para la prueba de esterilidad fueron controladas, obteniendo resultados satisfactorios durante todos los ensayos de la técnica evaluada.

Al realizar las pruebas bajo condiciones ambientales controladas se reducen falsos positivos por contaminación microbiana cruzada y se garantiza la asepsia del área donde se realiza la prueba de esterilidad. El proceso de limpieza y desinfección del área de trabajo, en este caso del área estéril, fueron primordiales para obtener buenos resultados durante la validación y a futuro para el análisis diario de la prueba de esterilidad para la técnica de filtración por membrana.

Las pruebas realizadas mostraron resultados satisfactorios gracias al correcto procedimiento empleado durante la validación, el personal capacitado con las habilidades para el manejo de equipos y materiales, y el uso de equipos calificados y validados que funcionan de la forma esperada.

8. CONCLUSIONES

Se realizó la validación de la retención microbiana en los filtros de acetato y nitrato de celulosa con un tamaño de poro de 0,45µm empleados en la

técnica de filtración por membrana para la prueba de esterilidad, obteniéndose resultados satisfactorios y reproducibles.

Se comprobó que en los filtros de acetato y nitrato de celulosa con un tamaño de poro de 0,45µm utilizados en la técnica de filtración por membrana retienen y recuperan satisfactoriamente los microorganismos contaminantes, esto se observa por la turbidez presentada en los medios de cultivo líquidos, los resultados se confirmaron por coloración de Gram.

La retención y recuperación de los microorganismos en los filtros de acetato y nitrato de celulosa se determinó con el líquido filtrado que se inoculó en los medios de cultivo; los resultados obtenidos no presentaron turbidez es decir no hubo crecimiento microbiano.

Se confirmaron las condiciones de montaje de la técnica de filtración por membrana siguiendo los parámetros de la USP 29 mediante la obtención de resultados que optimizan la técnica reduciendo repeticiones y minimizando riesgos en las pruebas.

Se verificó mediante la prueba de promoción de crecimiento que los medios de cultivo Fluido de Tioglicolato y Digerido de Caseína-Soja utilizados en la prueba de esterilidad poseen los nutrientes necesarios para favorecer el crecimiento de microorganismos contaminantes.

El crecimiento de los microorganismos utilizados en la prueba de promoción de crecimiento se verificó mediante espectrofotometría observándose disminución del % de tramitancia que indica el crecimiento de los microorganismos en los medios de cultivo, este crecimiento fue determinado en menos de 24 horas.

El crecimiento de los microorganismos presenta un modelo lineal demostrando así una relación directamente proporcional entre las variables, tiempo y crecimiento microbiano.

De acuerdo a los resultados obtenidos se actualizó el procedimiento operativo estándar POSM0017 – P002 “PROCEDIMIENTO PARA LA REALIZACIÓN DE PRUEBAS DE ESTERILIDAD” para la ejecución de la técnica de filtración por membrana empleada en el análisis de esterilidad en el laboratorio de Análisis Microbiológico y Químico AQM Ltda.

La capacitación oportuna de los analistas minimiza posibles errores, los riesgos de contaminación y asegura resultados confiables durante la validación y el transcurso habitual de las pruebas realizadas en el laboratorio.

El funcionamiento y el mantenimiento preventivo de los equipos garantizan que los procedimientos realizados y los resultados obtenidos son confiables para el estudio realizado.

La calidad de los medios de cultivo trabajados presentaron una característica importante para la recuperación de los microorganismos y la interpretación de resultados confiables, evitando falsos positivos.

9. RECOMENDACIONES

Es importante el buen manejo del equipo de filtración durante el análisis de productos estériles, mediante la técnica de filtración por membrana en un sistema abierto, por lo que se recomienda tener en cuenta el ajuste del equipo y los embudos, la ubicación del filtro de membrana dentro del embudo y la mínima manipulación del equipo para evitar cualquier contaminación cruzada.

Teniendo en cuenta los tiempos de crecimiento y recuperación de los microorganismos se sugiere un monitoreo visual frecuente de los medios de cultivo, Fluido de Tioglicolato y Digerido de Caseína-Soja, para una rápida detección de microorganismos contaminantes en productos evaluados.

Al monitorear el medio de cultivo Fluido de Tioglicolato se debe evitar la agitación para mantener las condiciones de anaerobiosis y así poder recuperar microorganismos anaerobios contaminantes como Clostridium sporogenes.

La actualización y revisión periódica de acuerdo a la normatividad es importante para el éxito de la pruebas y para obtener resultados óptimos y confiables.

Es fundamental el empleo de los microorganismos establecidos por la USP para la evaluación de controles positivos y así verificar la efectividad de la técnica de filtración.

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