En esta investigación se realizó la síntesis de NPs Ag por reacción del AgNO3 con el
extracto acuoso de Vaccinium corymbosum para posteriormente evidenciar el efecto antibacteriano de las mismas. Los elementos químicos en su forma nanométrica muestran propiedades distintas a las que se manifiestan en la escala macroscópica o bien cuando se encuentran en forma iónica; así, las NPs metálicas presentan propiedades electrónicas, magnéticas, catalíticas y ópticas únicas que difieren de aquellas que presenta el mismo material a granel. Debido a estas diferencias es preciso tener la certeza de que lo que se sintetizó son NPs Ag, para ello se emplearon técnicas de microscopía electrónica y espectroscopía Uv-Vis.
Las técnicas de microscopía electrónica (EM) más destacadas son la microscopía electrónica de transmisión (TEM) y la microscopía electrónica de barrido (SEM). Las imágenes TEM no sólo proporcionan el tamaño y la forma de las nanopartículas, sino también la morfología y el estado de agregación de las mismas9, 12.
La figura 1 muestra la caracterización de NPs Ag empleando TEM, a diferentes escalas de referencia se observan NPs en estados individuales y aglomeradas, así como también se observa la forma esférica de las mismas. Las NPs esféricas poseen un mayor efecto que aquellas que tienen otras formas geométricas, esto debido a su mayor área superficial y a la presencia de un mayor número de átomos superficiales disponibles para interaccionar con los diferentes componentes celulares de las bacterias.
408nm es el valor de λmáx del coloide sintetizado, lo que indica que los flavonoides,
terpenos, polifenoles diversos del extracto acuoso de arándano a concentración de 48% produce una reducción de la plata en el AgNO3, y se obtienen NPs de tamaño uniforme y
de forma esférica como lo muestra el TEM.
La figura 2, se observa el tamaño de las nanopartículas de plata que se han formado, observando que es de 13,19nm de diámetro; la cual este valor corresponde a una longitud de onda de 408nm aproximadamente.
En la figura 3, el espectro de UV-Vis de las NPs Ag muestra la banda de absorción con un máximo a 408nm asociado a la resonancia de plasmón superficial (SPR) (Figura 2).
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El fenómeno SPR ocurre porque los electrones en la superficie de una nanopartícula metálica oscilan al interactuar con una onda electromagnética y se induce un momento dipolar sobre la nanopartícula en un intervalo de tiempo. Cuando la componente eléctrica de la onda electromagnética (de un haz de luz visible) que incide sobre la nanopartícula oscila a la misma frecuencia que los electrones de esta, ocurre el fenómeno SPR. Metales como la Ag, el Au y otros metales alcalinos con electrones libres muestran resonancia del plasmón en el espectro visible, dando lugar a colores no observados en los mismos materiales a escala macrométrica. Las NPs de Ag poseen una intensa SPR en los intervalos de longitud de onda 400 – 430nm57.
Se ha reportado que a medida que el tamaño de nanopartículas metálicas aumenta, el pico de absorción tiende a ubicarse a longitudes de onda mayores por lo que, mediante la posición y la forma del pico es posible predecir el tamaño y polidispersidad de las NPs Ag59.
Pradeep reporta valores aproximados de longitudes de onda que permiten predecir el tamaño de nanopartículas de plata: a) Posición del pico: aproximadamente 400nm, 430nm y 438nm b) Tamaño de partícula: 10-14nm, 35-50nm, 60-80nm respectivamente. A menor longitud de onda del pico de absorción máximo, menor será el tamaño de las nanopartículas60.
La tabla Nº1 (Anexo 2) muestra que a mayor longitud de onda el tamaño de las nanopartículas es menor, lo cual contradice lo mencionado por Pradeep, esto tiene una explicación pues al observar la imagen TEM (Figura Nº1, Anexo 2) se aprecia que se ha formado un “Cluster” de nanopartículas. Los Clúster son cúmulos o agregados que se unen por fuerzas relativamente débiles como Van der Walls, fuerzas electrostáticas o de tensión superficial.
En las Tabla 1 y 2 se observa el efecto de las NPs Ag, expresado en las medidas de los halos de inhibición de crecimiento de las bacterias estudiadas. Al analizar ambas tablas, se evidencia que al aumentar el volumen de solución de NPs Ag en las placas se produce una mayor inhibición del crecimiento de ambas bacterias, esto debido a consideraciones importantes como el mecanismo de acción que es propio de la NP y la formación de un gradiente de concentración, el mismo que permite que la NP difunda desde el cilindro en el que se encuentra hacia el medio que lo rodea (bacterias en crecimiento).
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La acción de inhibición del crecimiento bacteriano por las nanopartículas de plata se debe a su actuación como metal, ion o NPs. Su efecto antimicrobiano se relaciona con varios procesos biológicos, entre ellos, la generación de especies de oxígeno reactivas (EROS) y la inducción de estrés oxidativo (EO), por el desacoplamiento del transporte de electrones y la desactivación de enzimas, particularmente a causa de la desnaturalización de los enlaces disulfuro de las proteínas bacterianas, que conduce a la muerte celular62.
En las bacterias, como en las células eucariotas, el blanco principal para su toxicidad es la alteración de la pared celular y de la membrana celular bacteriana, inhibiendo los procesos de respiración e interactuando con el azufre que contiene la membrana bacteriana y con los grupos fosfatos del DNA. Así, se impide la replicación y se inactiva la enzima fosfo-manosa isomerasa encargada de catalizar la conversión de manosa-6- fosfato a fructuosa-6-fosfato, intermediario de la glucólisis, por una vía común en bacterias para llevar a cabo el catabolismo de azúcar. No obstante, el mecanismo detonante de la toxicidad en las bacterias se debe a su interferencia con la ubiquinona o coenzima Q que en la mitocondria participa en el proceso respiratorio. La coenzima Q en las membranas, tiene una función antioxidante, de forma directa, contra la formación de lipoperóxidos o de manera indirecta, a través del reciclado de otros antioxidantes lipídicos como la vitamina D. La consecuencia del efecto de la Ag+ sobre la ubiquinona es el desacoplamiento del transporte iónico de sodio y potasio entre otros, de ahí su gran toxicidad y afectación63.
El análisis de varianza ofrece un valor de P, de la prueba estadística, menor a 0,05 lo que indica aceptar la hipótesis alterna (H1), es decir, afirmar que existen diferencias significativas entre las medidas promedio de los halos de inhibición de crecimiento de S. pyogenes y S. typhi (anexo 2).