La levadura marina viva usada en el presente trabajo fue seleccionada debido a que estudios microbiológicos previos la señalaban como un buen candidato para ser empleado como probiótico en acuicultura. Su adhesión al tracto gastrointestinal de los peces, su inocuidad y su habilidad para producir poliaminas constituyen algunas de sus características probióticas (Tovar et al., 2002; Tovar et al., 2004). La relación entre probióticos-sistema inmune puede ser utilizada como una alternativa para el manejo de poblaciones bacterianas indeseables en los sistemas de cultivo. En el presente trabajo, se evaluó el efecto de la levadura marina D. hansenii sobre el sistema inmune de la cabrilla sardinera Mycteroperca rosacea y de la dorada Sparus aurata expuestas a diferentes agentes patógenos presentes en los sistemas de cultivos.
La cabrilla sardinera M. rosacea es una especie sujeta a nuevos estudios y propuesta como candidata para la acuicultura en la región Noroeste de México. Los índices hematológicos evaluados en esta especie en condiciones de cultivo intensivo nos proporcionan una herramienta útil para el monitoreo de salud y como referencia en estudios posteriores, siendo estos datos los primeros obtenidos para esta especie.
En un primer experimento, se evaluó la adhesión de la levadura marina al intestino de la cabrilla sardinera y la dorada. Los resultados observados en ambas especies nos muestran una fuerte adhesión de D. hansenii en el intestino, siendo considerada esta característica un importante criterio para la selección de probióticos (Salminen et al., 1998). La capacidad de adhesión de la levadura marina D. hansenii al moco intestinal de otras especies puede ser relacionada con su presencia en la microflora natural de algunos teleósteos. En otros trabajos con levaduras del tipo Saccharomyces cereviciae ha sido demostrado su adhesión y colonización en el moco de peces y humanos (Nikoskelainen et
al., 2001; Kirjavainen et al., 1998). La adhesión de la levadura y su colonización en el
tracto gastrointestinal no es solo uno de los requisitos importantes en un probiótico, sino su permanencia en el mismo. En este estudio, al finalizar el ensayo experimental se tomaron muestras de intestino de cabrilla y dorada alimentadas con dietas suplementadas con levadura para corroborar la permanencia de ésta en el intestino de los peces en medio YPD-
agar. El resultado promedio de 9.6 x 103 UFC demuestra el grado de colonización y permanencia de D. hansenii.
La levadura marina fue administrada con la dieta y evaluada en dos tratamientos, un tratamiento control y una dieta suplementada con levadura al 1.1% (correspondientes a 106 UFC g-1) por 4 semanas; posteriormente los organismos fueron retados con el ectoparásito
Amyloodinium ocellatum, como se describe en el bioensayo I. Durante el tiempo de
exposición al parásito se observaron diferencias significativas en la mortalidad acumulada durante 7 días en los peces alimentados con la dieta suplementada con levadura respecto a la dieta control 40 y 90% respectivamente. El análisis microscópico realizado para el conteo de trofontes (etapa parasitaria) en las branquias de los peces infectados nos revela un caso agudo de amyloodiniosis; una de las enfermedades que más afectan a la acuicultura de peces marinos. La alta patogenecidad de este parásito puede ser atribuida al daño causado por el ataque de los trofontes a la piel de los peces y a severas alteraciones patológicas en las branquias (Kuperman and Matey, 1999).
Durante la infección con A. ocellatum, uno de las principales mecanismos de defensa del hospedero es la producción de anticuerpos (Woo, 1996; Cobb et al., 1998). Ha sido ampliamente demostrado que los probióticos (bacterias y levaduras) pueden estimular la producción de anticuerpos en humanos (Malin et al., 1996) y peces (Nikoskelainen et al., 2003). Un efecto similar fue observado en el presente estudio en el grupo alimentado con levadura en su dieta, en donde la producción de IgM se vio significativamente aumentada. En los mamíferos, aves y peces, las inmunoglobulinas pueden unirse a antígenos para su eliminación por la activación de la ruta clásica del complemento, pudiendo indirectamente neutralizar a los patógenos (Overath et al., 1999) incluso si se trata de una respuesta primaria (Sinyakov et al., 2002) como lo fue en este experimento. De igual manera, los niveles de IgM en los peces retados con Aeromonas hydrophila (bioensayo II) aumentaron significativamente en los peces alimentados con D. hansenii con respecto a la dieta control. Otro de los parámetros del sistema inmune que se vio significativamente estimulado en los tres experimentos fue la actividad de las enzimas antioxidantes: superóxido dismutasa y catalasa. La SOD acelera la reacción de O2- a peróxido de hidrógeno y agua y puede ser considerada la primera línea de defensa contra la toxicidad del oxígeno (Barnes et
al., 1999). En el sistema inmune de los vertebrados, las especies reactivas de oxígeno
(ERO) pueden generarse a partir de varios sucesos: uno de ellos es través de las células fagocíticas que producen grandes cantidades de peróxido de hidrógeno (Gamaley y Kluybin, 1999) o en casos de hipoxia, por la auto-oxidación de la hemoglobina, resultando en la generación de anión superóxido (Stocker y Frei, 1991). La exposición de los organismos a la producción de estos radicales libres puede aumentar las defensas antioxidantes representadas por la superóxido dismutasa, tal y como se observó en el bioensayo I. De acuerdo a trabajos previos, los niveles de esta enzima en las levaduras del género Saccharomyces cerevisiae o Candida polymorpha son menores a los de la levadura marina D. hansenii cepa C11, la cual constituye una fuente alterna para la obtención de la enzima superóxido dismutasa (Ochoa et al., 1995). En el bioensayo II, se detectó un aumento significativo en la actividad de ambas enzimas antioxidantes a diferencia de los bioensayos I y III en donde solo fue detectado un aumento de la SOD. Ante la infección con Aeromonas hydrophila en los peces, el hígado y los riñones son los principales órganos blancos de una septicemia aguda (Cipriano, 2001). Estos órganos son atacados aparentemente por toxinas bacterianas presentando de esta manera una intensa actividad fagocítica por los macrófagos (Huizinga et al., 1979) generando una producción elevada de radicales libres, producida por la combustión respiratoria durante la fagocitosis. La exposición de los organismos a los ataques pro-oxidativos puede incrementar las defensas antioxidantes, aumentando la síntesis de enzimas antioxidantes.
A nivel molecular y a diferencia del gen HSP-70, la expresión del gen CAT fue detectada en tejidos de hígado e intestino en los organismos alimentados con levadura en su dieta cuando fueron expuestos a la bacteria A. hydrophila. De esta manera, hay una correlación directa de la expresión del gen CAT en tejidos de hígado y los altos niveles basales de ésta enzima que fueron detectados en peces alimentados con levadura con respecto al control. El hígado es uno de los órganos donde el estrés oxidativo se presenta en mayores cantidades (Lin y Lin, 1997). La actividad de las enzimas antioxidantes y los niveles de radicales libres han sido correlacionados con varias condiciones fisiológicas y patológicas, incluyendo el estrés (Wojtaszek, 1997) como ocurrió en este estudio. El gen
dietas y no infectados con la bacteria. En células no estresadas, hay una producción constitutiva de estas proteínas de estrés que son requeridas en varios aspectos en el metabolismo de las proteínas para mantener la homeostasis celular (Fink y Goto, 1998). Se recomienda para investigaciones futuras analizar los niveles de HSP-70 por análisis inmunológicos como la técnica de ELISA utilizando diferentes tejidos para contrastar los niveles de expresión molecular con los índices basales.
En el tercer bioensayo se evaluaron varios parámetros del sistema inmune en leucocitos de juveniles de la dorada después de ser alimentados con levadura en su dieta. La actividad de fagocitosis, explosión respiratoria, citotoxicidad y peroxidasa se midieron in
vitro en leucocitos de riñón cefálico. En los análisis antes mencionados, se observó un
aumento significativo en peces alimentados con dietas suplementadas con Debaryomyces
hansenii. Los β-glucanos son polisacáridos estructurales de la pared celular de muchas
bacterias, levaduras y hongos (Rosenberger, 1976). Estos compuestos pueden estimular los mecanismos de defensa no-específicos a través de la activación de los macrófagos en peces (Kumari y Sahoo, 2006), como se observó en el presente estudio con juveniles de dorada
Sparus aurata.
Los análisis de expresión molecular en este estudio fueron llevados a cabo para evaluar el efecto de la inclusión de la levadura D. hansenii CBS 8339 en la dieta sobre la expresión de genes relacionados con el sistema inmune en hígado, riñón cefálico e intestino. De acuerdo a los resultados obtenidos por PCR en tiempo real, se observa significativamente la expresión de los nueve genes evaluados (Hep, IgM, TCRβ, NCCRP-1,
MHCIIα, CSF-1R, C3, TNFα e IL-1β), en cDNA de riñón cefálico de peces alimentados
con levadura en su dieta con respecto al grupo control. Selvarat et al. (2005) reportaron que la expresión de IL-1β en carpa fue inducida en macrófagos de riñón cefálico después de una aplicación con β-glucanos de levaduras. En peces el riñón cefálico es el principal órgano hematopoyético donde se lleva a cabo la producción y maduración de las células del sistema inmune. El presente trabajo demuestra que la levadura D. hansenii cepa CBS 8339 estimuló la expresión de genes relacionados con el sistema inmune a las cuatro semanas de alimentación, principalmente en el riñón cefálico. No obstante, se recomienda llevar a cabo muestreos a diferentes tiempos (semanas) y en diferentes tejidos, para determinar de
manera mas precisa y detallada los patrones de expresión de cada gen y detectar eventuales picos de expresión.