Discusión

En este primer capítulo se mapearon epitopes B en caseínas bovinas y Gly m 5.0101 empleando el anticuerpo mAb 1D5 específico de α-caseína bovina, utilizando el método EMapp MALDI que combina la purificación de péptidos por inmunocaptura con la determinación de las masas moleculares por espectrometría de masas EM MALDI-TOF. La combinación de ambos procedimientos resulta de mayor eficiencia y rapidez en comparación con los métodos usados convencionalmente. Este tipo de metodología no ha sido publicado para el análisis de epitopes alergénicos. La selección y análisis de los péptidos capturados por los anticuerpos proporcionan la base para la localización de sitios antigénicos y su mapeo en la molécula proteica. Este método fue aplicado con éxito para anticuerpos con una afinidad de unión intermedia a baja (KD entre 10-7_-10-6 _{M) y por lo tanto puede ser aplicable a la mayoría de los} anticuerpos que se unen a epitopes lineales. Una ventaja adicional de esta metodología es la sensibilidad de EM MALDI-TOF, lo cual significa que se requiere muy poca cantidad tanto de antígeno como de anticuerpo para evidenciar la interacción molecular. Además, representa en forma más ajustada o fisiológica la interacción epitope-paratope, ya que la inmunocaptura se realiza con el antígeno en solución, y además en este caso se emplearon caseínas bovinas purificadas a partir de su fuente natural (comerciales). Asimismo, utilizando diversas proteasas específicas se logra obtener de una manera rápida una gran variedad de fragmentos peptídicos, etapa comparable a la síntesis rápida de péptidos o a la expresión de genes recombinantes de deleciones mutantes. Las etapas de digestión (12 hs), inmunocaptura (aprox. 4 hs), y determinación de las masas moleculares de cada muestra (aprox. 1 min), permiten identificar epitopes inmunoreactivos, de 10-25 aminoácidos, en un solo día. Este punto es relevante al momento de analizar un elevado número de proteínas o de anticuerpos.

En nuestro trabajo, la aplicación de la técnica de EMapp MALDI con los anticuerpos mAb-CB permitió identificar epitopes de reactividad cruzada entre CB y PS: S1-caseína bovina, - caseína bovina y en Gly m 5.0101 de soja.

Las caseínas (principalmente la S1-caseína) están descriptas como los principales alergenos de la leche bovina. Son numerosos los trabajos que estudiaron los epitopes inmunogénicos en estas proteínas, por lo que buscamos en la base de datos “Immune Epitope Database and

que aquí se identificaron. Se encontró que los cinco epitopes de las caseínas bovinas mapeados con nuestros mAbs se encuentran descriptos en esta base de datos como epitopes inmunoreactivos, y que al menos 11 trabajos publicados caracterizan a los mismos como epitopes B y/o T. En estos trabajos se describe la capacidad de unión de los epitopes a anticuerpos IgE empleando diversas metodologías. Para ser más precisos, el epitope 19NLLRFFVAPFPE30 de S1-caseína ha sido informado por diferentes trabajos como un epitope IgG e IgE inmunodominante (Cerecedo et al., 2008; Chatchatee et al., 2001a; Cocco et al., 2003; Elsayed et al., 2004a; Lin et al., 2009; Schulmeister et al., 2009; Spuergin et al., 1996) y como epitope T inmunodominante (Elsayed et al., 2004b). Asimismo, los péptidos 91YLGYLEQLLR100 y 97QLLRLKKYKVPQLE110 también de S1-caseína fueron descriptos como epitopes IgG e IgE inmunodominantes (Chatchatee et al., 2001a; Cocco et al., 2003; Elsayed et al., 2004a; Enomoto et al., 1990; Järvinen et al., 2002; Lin et al., 2009; Schulmeister et al., 2009; Spuergin et al., 1996) y como epitopes T inmunodominantes (Elsayed et al., 2004b; Enomoto et al., 1990; Nakajima-Adachi et al., 1998). Para el caso de la -caseína bovina la información es más acotada y se encuentran pocos trabajos publicados que hayan mapeado epitopes B, mientras que no existen reportes de epitopes T. Los péptidos que hemos identificado en nuestro trabajo en la -caseína se encuentran en la literatura descriptos como epitopes IgG e IgE (Cerecedo et al., 2008; Chatchatee et al., 2001b; Järvinen et al., 2002; Lin et al., 2009). Asimismo, dos de los tres péptidos de Gly m 5.0101 de soja (la subunidad de la -conglicinina) mapeados por estos mismos mAbs, los péptidos: 1) de 2260,2 Da 103LRRHKNKNPFLFGSNRFE120 y 2) de 4164,0 Da 121TLFKNQYGRIRVLQRFNQRSPQLQNLRDY RILE152 (que se encuentran en la región core de la proteína) están descriptos como epitopes antigénicos (Fu et al., 2007). Si bien con estos anticuerpos se han identificado epitopes que ya han sido informados como epitopes IgE e IgG, no se ha descripto la posibilidad que se comporten como epitopes compartidos o de reactividad cruzada entre estos dos sistemas proteicos no relacionados. Sin embargo, estos resultados in vitro deben considerarse con precaución. No podemos asegurar que una reactividad cruzada in vitro presente relevancia clínica sin recurrir al estudio de un sistema biológico in vivo. Estos resultados sólo reflejan lo que ocurren con los anticuerpos en fase fluida.

hecho refleja la importancia de estas secuencias como epitopes inmunodominantes en las caseínas. Por lo tanto proponemos que estos mismos epitopes podrían ser los responsables de generar la intolerancia clínica observada en algunos pacientes alérgicos a leche de vaca que son tratados con leches de estas especies animales (Docena et al., 2002).

Por otro lado, Gly m 5.0101, subunidad de la -conglicinina de soja, ha sido descripta como uno de los principales alergenos de la soja junto con las subunidades α’ y β formando los

trímeros de -conglicinina, que es la proteína mayoritaria de la fracción 7S de las semillas de soja. La proteína posee una zona amino terminal llamada región de extensión, de aproximadamente 150 aas, muy rica en aminoácidos ácidos. Esta zona de la molécula ha sido descripta como la más inmunogénica y es compartida con la subunidad ’. Además presenta

una región común con las subunidades ’ yβ, que se denomina región core, cuya estructura la componen conformaciones de hélices y barriles β. Esta región constituye un dominio llamado cupina, que también se encuentra en otras proteínas alergénicas vegetales (Mills et al., 2002). Las tres proteínas presentan un alto porcentaje de similitud secuencial, sin embargo las propiedades fisicoquímicas y fisiológicas de las tres subunidades son diferentes (Petruccelli et al., 2005). La información obtenida de los alineamientos de las distintas subunidades de la β- conglicinina (figura 7A) nos muestra que los tres epitopes mapeados en la subunidad α se

encuentran en la zona core común con las subunidades ’ y β, lo cual explica el reconocimiento de los mAbs específicos de caseínas con las 3 subunidades presentes en los extractos de las semillas de soja (figura 2B).

Figura 7. A: Alineamientos de las tres subunidades de la -conglicinina de soja. Los epitopes de reactividad cruzada mapeados en la sub α están marcados en rojo. B: Representación tridimensional de la estructura PDB de la subunidad de la -conglicinina de soja. La estructura fue modelada utilizando un servidor SWISS-MODEL, en rojo se coloreó el péptido 1) de 2260,2 Da y con verde el péptido 2) de 4164,0 Da.

Utilizando el servidor SWISS-MODEL (

http://swissmodel.expasy.org/workspace/index.php?func=tools_structureassessment) se obtuvo la estructura tridimensional de la subunidad α de la -conclicinina. Los tres péptidos mapeados en esta proteína de soja 1) de 2260,2 Da 103LRRHKNKNPFLFGSNRFE120, 2) de 4164,0 Da 121TLFKNQYGRIRVLQRFNQRSPQLQNLRDYRILE152 y 3) de 1864,0 Da 505GNKGRKGPLSSILRAFY521 están localizados en la región core. Como el péptido 3) se localiza en una región de la proteína no modelada, la estructura PDB que se muestra en la figura 7B sólo contiene a los péptidos 1) y 2). Puede observarse que ambos péptidos se encuentran en la superficie de la molécula y accesibles al solvente, por lo tanto también se encuentran accesibles a los anticuerpos.

Además de mostrar reactividad cruzada con proteínas de la leche de vaca, las proteínas de soja muestran reactividad cruzada con otras leguminosas, como el maní (Bernhisel-Broadbent and Sampson, 1989). Gly m 5.0101 y el principal alergeno del maní, Ara h 1, pertenecen a la familia de las vicilinas (proteínas de reserva), que han sido descriptas como alergenos importantes. Empleando péptidos sintéticos solapados se han descripto 23 epitopes IgE en Ara h 1 (Burks et al., 1997). Ambas proteínas muestran un 60% de identidad secuencial y algunos de los epitopes mapeados en maní se alinean con los epitopes de reactividad cruzada con leche que aquí hemos mapeado en Gly m 5.0101 (figura 8). Otra vicilina alergénica es la proteína de las lentejas Len c1, este alergeno conserva homología secuencial con Gly m 5.0101 (56% de identidad) y con Ara h1 (50% de identidad), pero no se ha descripto alergenicidad cruzada con alergenos de la soja. Consecuentemente con ello los epitopes IgE mapeados en Len c 1 (muestra epitopes IgE entre los aminoácidos 314-399 (López-Torrejón et al., 2003)) no se alinean con los epitopes que hemos mapeado en Gly m 5.0101 (figura 8).

Figura 8. Alineamientos de las vicilinas alergénicas de soja (Gly m 5.0101), maní (Ara h 1) y lenteja (Len c1). Los epitopes mapeados en la sub α están marcados en rojo y subrayados los aminoácidos de los epitopes de Ara h 1 que coinciden con los epitopes mapeados de soja.

La conservación de la secuencia aminoacídica entre los epitopes aquí mapeados en Gly m 5.0101, y los epitopes IgG e IgE mapeados en el alergeno Ara h 1 (ambas vicilinas provenientes

de especies que exhiben reactividad cruzada) refuerza el concepto del uso estos anticuerpos como herramientas de detección de epitopes lineales de reactividad cruzada.

El análisis de estas secuencias identificadas experimentalmente, junto con los péptidos inmunodominantes hallados en la búsqueda bibliográfica, nos permitió resaltar las características de los epitopes responsables de la reactividad cruzada. Esto nos permite concluir que los epitopes de reactividad cruzada presentan una longitud de 5-7 aminoácidos, y los aminoácidos críticos para la reactividad inmunoquímica serían los polares, que

estructuralmente actuarían de “anclaje” (R22_{, Q}97_{, R}99 _{para S1-caseína y K}109_{, R}118 _{y R}518 _para Gly m 5.0101) flanqueados por aminoácidos hidrofóbicos que estabilizarían la interacción.

En conclusión, en este primer capítulo se aplicaron diversas técnicas para la caracterización de mAb-CB como inmunoblots, biacore y un novedoso método de mapeo de epitopes que emplea como técnica de detección la espectrometría de masas (técnica de muy alto rendimiento). Este análisis permitió identificar epitopes en caseínas bovinas y en un alergeno mayor de la soja que podrían ser los responsables de la reactividad cruzada inmunoquímica observada, y de la alergenicidad cruzada descripta en pacientes alérgicos a leche bovina. Además la secuencia aminoacídica de estos epitopes ha sido descripta en otros alergenos como epitopes inmunodominantes IgG e IgE, incluyendo caseínas de distintas especies de mamíferos que han sido ampliamente reconocidas como de reactividad cruzada.

Hemos basado nuestro análisis en el empleo del mAb 1D5 específico de α-caseína bovina, por ser el que mejor resultado inmunoquímico arrojó al estudiar las distintas caseínas y proteínas de soja.