Generalidades

La prevalencia de las enfermedades alérgicas alcanza actualmente proporciones epidémicas en ciertas poblaciones y para ciertos sistemas proteicos (Linhart and Valenta, 2012). Aunque se han descripto cientos de moléculas capaces de inducir una respuesta inmune inapropiada - la reacción alérgica - se ha tratado de esclarecer cuáles son las características estructurales y funcionales que determinarían la capacidad de estas moléculas de interactuar y activar mecanismos de la inmunidad innata y adaptativa. El conocimiento alcanzado en este campo es escaso y sólo para algunos alergenos se han identificado porciones de la molécula capaces de activar la inmunidad innata (capacidad adyuvante) y la inmunidad adaptativa (epitopes B y T) (Wills-Karp et al., 2010).

Como se mencionó anteriormente, las proteínas de la leche de vaca y la soja han sido incluidos

dentro del “grupo de los 8” por su importancia como alergenos alimentarios. En particular la

leche de vaca es actualmente el principal alergeno alimentario en numerosas regiones (Järvinen and Chatchatee, 2009), incluyendo nuestro país (Orsi et al., 2009). La alta exposición y la temprana edad de los pacientes parecen ser los dos principales factores que determinan su alergenicidad, junto a la elevada inmunogenicidad de sus proteínas, especialmente las caseínas (Docena et al., 1996). Con respecto a las proteínas de soja, dado el elevado valor nutritivo de las mismas, su aceptabilidad por los pacientes y su reducido costo, determinan que las formulaciones a base de estas proteínas sean frecuentemente utilizadas como sustituto lácteo en el tratamiento de los pacientes alérgicos a leche de vaca con edades comprendidas entre los 6 meses y 2 años de edad. Sin embargo, son numerosos los trabajos que describen una intolerancia clínica al inicio del tratamiento (Ahn et al., 2003; Katz et al., 2008; Klemola et al., 2005; Szaflarska-Szczepanik and Gasiorowska, 2003; Zeiger et al., 1999). Esta situación también ha sido descripta en pacientes de nuestro país (Orsi et al., 2009), y complica marcadamente el tratamiento, dado que el médico debe utilizar un nuevo sustituto lácteo, y las opciones comerciales son muy restringidas. Por otro lado, las proteínas de la soja son muy utilizadas por la industria alimenticia y la no alimenticia, y esto ha determinado que la población en general se encuentre altamente expuesta a estos alergenos. Llamativamente, no se ha observado hasta el momento que la alergia alimentaria a la soja sea un problema

sanitario importante, inclusive en niños durante la primera infancia, etapa en la cual se observa la mayor incidencia de las alergias alimentarias.

Las caseínas bovinas representan el 80% de las proteínas de la leche de vaca y están constituidas por cuatro moléculas: αS1-, αS2-, β- y -caseína cuya abundancia en la leche vacuna es del 32%, 10%, 28% y 10% respectivamente. Las caseínas han sido informadas como el principal componente alergénico de la leche de vaca (Docena et al., 1996). Las caseínas son proteínas fosforiladas, con un alto contenido de aminoácidos hidrofóbicos, que forman miscelas en suspensión con poca estructura terciaria. Además, la S1-caseína no es sintetizada por la glándula mamaria humana y este puede ser un factor importante que determina su elevada inmunogenicidad y alergenicidad (Wal, 2004). Para el estudio de la alergia a leche de vaca en nuestro laboratorio se obtuvieron anticuerpos monoclonales del isotipo IgG1 específicos de caseínas bovinas (mAb-CB) (Docena et al., 2002) los cuales han sido empleados en este trabajo como una herramienta inmunológica para la identificación de proteínas de soja de reactividad cruzada (Curciarello et al., 2008; Rozenfeld et al., 2002). Teniendo en cuenta la complejidad de las alergias mediadas por IgE y la necesidad de contar con herramientas que permitan comprender las bases moleculares y celulares de los mecanismos subyacentes en este capítulo nos propusimos identificar epitopes de reactividad cruzada en proteínas de leche y soja. Inicialmente demostramos que las proteínas mayoritarias de la semilla de soja, las globulinas 7S y 11S, son reconocidas por los anticuerpos monoclonales y antisueros policlonales específicos de caseínas bovinas obtenidos en conejos y cabras (Curciarello et al., 2008; Rozenfeld et al., 2002). Posteriormente, evidenciamos experimentalmente la importancia in vivo de este reconocimiento inmunoquímico, empleando un modelo murino de alergia a proteínas de leche bovina (Smaldini et al., 2012).

Sobre la base de estos resultados decidimos profundizar en las bases moleculares que gobiernan este fenómeno. El estudio e identificación de epitopes inmunodominantes (B y/o T) lineales y conformacionales puede ser abordado mediante la aplicación de diferentes técnicas. Esta información resulta relevante al momento de caracterizar la inmunogenicidad de los alergenos para el desarrollo de nuevas terapias dirigidas a la inmunomodulación del sistema inmune o la instauración de los mecanismos de tolerancia que permitan corregir la respuesta inmune inapropiada instaurada en el paciente. Para este fin el empleo de péptidos de baja o

nula capacidad de activación de basófilos y mastocitos (a través de epitopes B), pero con capacidad de activación de linfocitos T (a través de epitopes T) permite plantear terapias correctivas con una reducida capacidad de generación de reacciones adversas, las cuales constituyen la principal causa de fracaso o abandono del tratamiento (Linhart and Valenta, 2005). Para poder elegir un candidato peptídico a incluir en una estrategia terapéutica de este tipo (inmunoterapia) es necesario caracterizar los epitopes lineales en las proteínas alergénicas. Para el mapeo de epitopes, en general se suele recurrir al uso de péptidos obtenidos por síntesis química (por ejemplo SPOT síntesis) (Carter and Loomis-Price, 2004; Reineke et al., 2001), o de péptidos obtenidos en forma recombinante empleando bacteriófagos que expresan bibliotecas aleatorias de péptidos de 7-12 residuos de aminoácidos (phage display de péptidos) (Scott, 1992; Scott and Smith, 1990). También se suele recurrir a la expresión recombinante de fragmentos polipeptídicos de mayor longitud lo que permite estudiar epitopes lineales y conformacionales (Xia et al., 2010). El principal inconveniente en el desarrollo de estas técnicas suele ser su elevado costo y tiempo que insumen. Por esta razón para la identificación de los epitopes de reactividad cruzada decidimos recurrir a tecnologías de alto rendimiento como es la proteómica funcional, en una de sus disciplinas conocida como inmunoproteómica. Este término es utilizado para describir el empleo de técnicas de espectrometría de masas (EM) para estudiar interacciones de péptidos con el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) o con anticuerpos. Teniendo en cuenta la alta sensibilidad, la alta precisión en la determinación de las masas moleculares y la alta capacidad de análisis las técnicas de espectrometría de masas ocupan actualmente un lugar destacado en la identificación de moléculas biológicas, en el estudio de los mecanismos básicos inmunológicos, y en el desarrollo y seguimiento de tratamientos profilácticos y terapéuticos (Koehler et al., 2011; Lillehoj et al., 2007; Soriani et al., 2010).

De los métodos de espectrometría de masas se optó por emplear ionización MALDI (Matrix- Assisted Laser Desorption/Ionizacion o desorción/ionización láser asistida por matriz) y un analizador de tiempo de vuelo (TOF, Time-Of Flight) en el que los iones se separan en función de su relación masa/carga (m/z) tras ser acelerados en un campo eléctrico, método conocido como MALDI-TOF. Esta metodología es rápida (menos de 1 min para determinar masas moleculares de péptidos), sensible (detecta cantidades inferiores a 1 pmol) y precisa para la

determinación de la masa molecular, lo que permite una rápida identificación de proteínas proveniente de sus fuentes naturales y realizar estudios de las modificaciones postraduccionales (proteólisis, glicosilación, fosforilación y oxidaciones) sufridas por las proteínas. Está técnica combinada con cromatografía de inmunoafinidad ha sido aplicada al mapeo de epitopes, habiéndose desarrollado variantes metodológicas para facilitar este tipo de análisis (Lu et al., 2009; Suckau et al., 1990; Zhao and Chalt, 1994).

En este capítulo hemos aplicado esta metodología para el mapeo de epitopes lineales. Básicamente consiste en hidrolizar la molécula blanco empleando proteasas de distinta especificidad, seguido de una incubación con los anticuerpos (en nuestro caso los mAb-CB) cuyos epitopes específicos se desea mapear. Posteriormente se aíslan los complejos anticuerpo-péptido empleando esferas magnéticas y se analiza la composición de los péptidos capturados por desorción de su complejo a los anticuerpos. La comparación de los péptidos antes y después de la captura inmunoquímica permite la identificación de él o los péptidos reconocidos por el anticuerpo (Koehler et al., 2011; Soriani et al., 2010). Aquí se emplearon los anticuerpos monoclonales específicos de las distintas caseínas bovinas, las caseínas purificadas y una proteína recombinante de soja (Gly m 5.0101). Una vez identificados los epitopes reactivos los resultados de inmunoproteómica fueron complementados con biología computacional estructural para comprender las características estructurales de caseínas bovinas y de las proteínas de soja responsables de la reactividad cruzada.