6.1 Microorganismos de estudio
El banco para el microorganismo de estudio (Salmonella spp.) se realizó con una
concentración inicial de 33 x 108 UFC/ml, manteniéndose constante durante todo el
estudio ya que hasta el sexto mes no se disminuyó la unidad logarítmica, manteniéndose en 108. Para esta clase de microorganismos, se reporta un elevado
porcentaje de supervivencia en distintos medios de conservación, debido a la presencia de factores de virulencia que le permiten soportar temperaturas bajas y ambientes adversos (Meza et al., 2002). Además durante el estudio la cepa no
presentó modificaciones a nivel metabólico y tampoco se registró contaminación de otros microorganismos.
6.2 Elaboración de curvas de crecimiento
La cepa control (S. enteritidis) presentó valores de absorbancia y recuento en placa
(figura 7 y 8) mucho mayores comparados con la cepa de estudio (Salmonella spp).
Esto puede adjudicarse posiblemente al origen “salvaje” de la cepa en estudio ya que en este tipo de microorganismos, adaptados a los ambientes adversos, el metabolismo es más rápido logrando degradar sustratos en un menor tiempo y culminando su ciclo de vida en un período de tiempo mas corto, y ello se evidencia al iniciar la fase estacionaria 2 horas antes que la cepa control, fase en la cual los microorganismos son más resistentes al estrés en comparación con la fase de logarítmica (Taylor-Robinson et al., 2003; O’Bryan et al., 2006). Este factor es
importante ya que en el medio ambiente estos microorganismos son competidores eficientes frente a hongos y actinos que están presentes en el suelo, lo que le permite aumentar la población y de esta manera poder diseminarse dentro del suelo.
(caldo BHI sin suplementos), un período de tiempo de 18 horas para iniciar la fase estacionaria, comparadas con las 8 horas requeridas en este estudio. Esto se debe posiblemente a la elaboración del inóculo previo a la curva de crecimiento, ya que mediante esta metodología se logra un proceso previo de adaptación por parte de la cepa, propiciando de esta forma curvas de crecimiento en menor tiempo (Walker et al., 1990; Gay et al., 1996).
6.3 Microcosmos
La resistencia de Salmonella spp a diferentes tratamientos térmicos ha sido
evaluada principalmente en alimentos como huevos (Garibaldi et al., 1969), leche
líquida (Dega et al., 1972), leche en polvo (Read et al., 1968) carne de pollo
(O´Bryan et al., 2006) y harina de maíz (VanCauwenberge et al., 1981). Sin
embargo son pocos los estudios que reportan la termorresistencia de Salmonella
spp en microambientes a base de compost y en caldo compost, a pesar de ser éste un insumo agrícola que en los últimos años ha adquirido una elevada importancia en los procesos agroindustriales (Tchobanoglous, 1994). Es posible que la falta de datos referenciados esté relacionado con el hecho de que sólo en años recientes se han presentado brotes de Salmonella asociado al consumo de vegetales donde las
fuentes de contaminación han sido el agua y los abonos (Solomon et al., 2002;
Natvig et al., 2002; Warriner et al., 2003).
Al someter las muestras de compost a temperatura de 70ºC durante 9 semanas continuas, se impide el desarrollo normal de éste y por ende el comportamiento no será el típico esperado. Las 3 fases que dividen el proceso, mesófila, termófila y de maduración (Sansford & MacLeod, 1998), no se llevaron a cabo debido al ambiente extremo al cual fueron sometidas, razón por la cual variables dependientes como el pH se vieron afectadas, presentando también un comportamiento anormal durante el estudio.
orgánicos por parte de los microorganismos fermentadores facultativos (Droffner & Brinton, 1995). Durante la primer semana de estudio, el microcosmos exhibió el mismo comportamiento descrito anteriormente presentando una leve disminución en el pH acompañado de la reducción en la población de Salmonella spp (figura 9).
Ésta disminución en el crecimiento puede deberse a que el pH óptimo para
Salmonella spp oscila entre 5.5 y 7.4, siendo los valores más cercanos al neutro los
más favorables para su desarrollo (Weissinger et al., 2000), resultando un pH de 6.0
a temperatura de 70ºC sumamente hostil para su supervivencia ya que se dificulta la síntesis de enzimas extracelulares encargadas de degradar el material orgánico obstaculizándose de esta forma la toma de nutrientes por parte del microorganismo (Tiquia et al., 1998).
Por otro lado, en la primera semana de tratamiento disminuyó la población inicial del tratamiento 1 hasta 5 NMP/4g; y el tratamiento 2 hasta 2.13 NMP/4g, pero en la segunda semana el incremento del pH estuvo acompañado de un alza poblacional que alcanzó los mismos valores en ambos tratamientos, 6.7 y 6.58 NMP/4g, sugiriendo que en ambos tratamientos, independientemente de la concentración inicial de Salmonella spp, el medio posiblemente le proporciona al microorganismo
las condiciones necesarias para recuperarse de la injuria sufrida a causa de la temperatura a la que fue sometida. Estas condiciones hacen referencia al sustrato disponible y a la protección al calor suministrada por las partículas de gran tamaño presentes en el compost (Galindo & Londoño, 2005), ya que como se demostró en estudios llevados a cabo por Natvig et al., (2002) y Franz et al., (2005) un tamaño de
partícula mediano en suelos favorece la retención de agua y disminuye la tensión de oxígeno, incrementando las posibilidades de colonización de los microorganismos, garantizando la sobrevivencia de éstos en el suelo.
A partir de la tercera semana la concentración de Salmonella spp en ambos
tratamientos fué <0.006473 NMP /4g, lo cual sugiere que la cepa al ser sometida a
esta temperatura durante un largo período de tiempo inicia su etapa de muerte, debido a que es una temperatura que está en el límite de supervivencia de la bacteria y si la exposición al calor es constante a través del tiempo se alcanza un
es inevitable e irreparable (Doyle & Mazzotta, 2000), es allí donde se llega a la destrucción total del microorganismo.
Teniendo en cuenta lo anterior, si bien después de la segunda semana no se encontró crecimiento de Salmonella spp en el microcosmos, es posible que en
compost con poblaciones mayores de éste microorganismo, el tiempo de supervivencia pueda ser mayor, además es importante señalar que a temperatura de 70ºC durante 9 semanas seguidas se puede ver inhibido el crecimiento de actinomycetes, hongos y bacterias esporoformadoras, quienes son los microorganismos encargados de descomponer proteínas, degradar ácidos orgánicos y transformar el nitrógeno en amoníaco, para de esta forma alcalinizar el pH del compost (Sundberg et al., 2004). Esto podría ser la causa del pH ácido del
medio durante todo el tratamiento y uno de los principales factores que limitó el desarrollo de Salmonella spp.
6.4 Curvas de muerte térmica
Las curvas de muerte térmica realizadas tanto en caldo BHI (pH 5.5 y 7.0) como en caldo compost, no muestran una tendencia linear decreciente, por el contrario exhiben un comportamiento particular conocido como shoulders (hombros) o
comportamiento bifásico, el cual puede deberse a varias razones como la heterogeneidad dentro de la población o la adaptación al calor durante el tratamiento térmico (Stringer et al., 2000).
Teniendo en cuenta los controles llevados a cabo en el desarrollo del estudio, la adaptación al calor de la cepa de Salmonella spp durante la elaboración de las
curvas es probablemente la causa por la cual no se presenta un comportamiento linear decreciente. La adaptación al calor por parte de la cepa en estudio puede relacionarse con la síntesis de proteínas de choque térmico y/o el desarrollo de injuria bacteriana (Asselt & Zwietering, 2006).
la población inicial de Salmonella spp. durante los primeros 15 a 30 minutos de
tratamiento, tiempo después del cual se presenta un leve incremento en la población microbiana que se mantiene estable durante cerca de 30 minutos antes de presentar una disminución linear en la población (figura 11 y 12).
Éste fenómeno se atribuye principalmente a la injuria bacteriana, consistente en daños subletales a nivel de rRNA que cambia la fisiología de la célula bacteriana causando pérdida de la integridad de la membrana celular y por consiguiente el desperdicio de una gran variedad de constituyentes intracelulares. Este daño puede ser causado por radiaciones, deshidratación, congelación o temperaturas cercanas al punto de ebullición (Ray, 1993).
A nivel molecular la injuria bacteriana consiste en fenómenos a nivel intracelular: la inducción de la síntesis de proteínas de choque térmico y la degradación de material ribosomal. La inducción de la síntesis de las proteínas de choque térmico (HSP) puede presentarse antes o durante la aplicación de calor y conlleva a un incremento significativo en la resistencia a la temperatura y a otros factores adversos (Lindquist & Craig, 1988).
Adicionalmente, se sugiere que los sobrevivientes iniciales durante un tratamiento térmico pueden con el tiempo ganar protección adicional a partir del material celular proveniente de la muerte de otras células al comienzo de este tratamiento (Humpheson et al., 1998), siendo éste uno de los posibles factores de la
termorresistencia de la cepa si se tiene en cuenta que las curvas de muerte térmica se iniciaron con recuentos de 108 UFC/ml y 10 ml de suspensión inicial, una
cantidad elevada comparada con estudios recientes en donde se emplean cantidades de 0.1 a 1 ml (Brackett et al., 2001; Bacon et al., 2003; Leguérinel et al.,
2007).
Otro posible factor asociado a la termorresistencia es la producción de componentes extracelulares a nivel de membrana celular, debido a que es allí en donde se ve afectada la permeabilidad y por ende la pérdida de material citoplasmático. En
aplicación de un tratamiento térmico, la expresión de 7 proteínas con pesos moleculares de 14, 16, 21, 23, 60, 75 y 89 KDa, relacionando su producción con el incremento de la resistencia al calor por parte de estos microorganismos (Xavier & Ingham, 1997). Si bien no se ha comprobado que se trata de proteínas que confieran única y exclusivamente termorresistencia, si se ha reportado su papel en la modificación de la pared celular a nivel de conformación para disminuir la permeabilidad y por ende limitar la pérdida de material intracelular (Xavier & Ingham, 1997; Humpheson et al., 1998). Por consiguiente, es posible que durante el
tratamiento térmico ocurra la producción de proteínas de choque térmico (HSP) en una pequeña cantidad de células y conlleve a la aparición de colas (tails) en las
curvas de microorganismos recuperados.
De igual forma, se ha encontrado que S. typhimurium requiere de la síntesis de
proteínas durante la recuperación después de un tratamiento térmico para sintetizar la subunidad de RNA 17S y proteínas alternas como lo son las de choque térmico (HSP), las cuales le permiten resistir durante mas tiempo el calor y recuperarse en mayor cantidad en un medio de cultivo luego de sufrir injuria (Witter, 1981).
La injuria bacteriana también viene acompañada de la degradación completa de la partícula ribosomal 30S y una ligera alteración de la partícula 50S. Estas dos partículas conforman el ribosoma el cual es responsable de la síntesis de proteínas en la célula. Durante un procedimiento de choque térmico a microorganismos como
Staphylococcus aureus y Salmonella typhimurium se encontró que el RNA 23S,
asociado con la partícula ribosomal 50S, permanecía intacto mientras el 16S, asociado con la partícula ribosomal 30S, era degradado por completo (Witter, 1981). La concentración inicial de microorganismos con la cual se realizaron las curvas de muerte térmica puede ser fundamental en el comportamiento exhibido por la cepa, debido a que un elevado número de células/ml facilita la interacción célula-célula en el cultivo y la formación de conglomerados que resisten mejor las condiciones térmicas extremas (Taylor-Robinson et al., 2003). De igual forma, una elevada
resultado de una rápida disminución en el oxígeno disuelto (causado por la respiración de las células) que reduce el daño oxidativo al microorganismo (Doyle & Mazzotta, 2000).
Otro factor importante a tener en cuenta es el medio en el cual se lleva a cabo el ensayo. Si se observan detenidamente los resultados se notará la elevada termorresistencia que presenta Salmonella spp en caldo BHI a pH 7,0 en
comparación con el caldo compost (figura 9). Esto puede deberse a que los medios con algún tipo de azúcar (el caldo BHI contiene D (+) glucosa 2g/l) como sacarosa, fructosa o glucosa (Goepfert et al., 1970), tienden a disminuir el aW y deshidratar
parcialmente las células, incrementando de esta forma su resistencia al calor (Corry, 1974; Baird-Parker et al., 1970). En igual sentido, se ha reportado que el calor
favorece la interacción de componentes de bajo peso molecular y cationes divalentes presentes en el medio de calentamiento, con componentes de la superficie celular, resultando en la estabilización de la membrana externa y el subsiguiente incremento en la tolerancia al calor por parte de las células (Sergelidis & Abrahim, 2009).
De la misma forma, sustancias como la trimetilglicina (betaína) y la carnitina (4- trimetilamino-3-hidroxibutirato) presentes en el caldo BHI, han sido reportadas como sustancias termoprotectoras debido a que estabilizan la membrana celular luego de un proceso térmico, e incluso por estimular la síntesis de proteínas de choque térmico (HSP) (Ryser & Marth, 1999; Schultzen et al., 2007). La base molecular de
la acción de la betaína y la carnitina radica en que son sustancias clasificadas como osmoprotectoras, y su actividad se fundamenta en el hecho de que pueden acumularse al interior de la célula en concentraciones elevadas sin afectar las funciones citoplasmáticas, restaurando de esta forma la turgencia y aumentando la osmolaridad externa (Angelidis & Smith, 2003). La betaína y la carnitina son constituyentes del caldo BHI (Lynne, 2004), medio de cultivo empleado en este estudio para las curvas de crecimiento y de muerte térmica, por consiguiente, su uso al parecer favoreció la termorresistencia de la cepa estudiada.
Igualmente, el medio de recuperación juega un papel fundamental ya que las células injuriadas pueden repararse y crecer en un medio nutritivo pero son incapaces de desarrollarse en un medio selectivo debido al incremento en la sensibilidad hacia ciertos reactivos químicos empleados para aumentar la selectividad en los medios de cultivo (Ray, 1993). Boziaris et al., (1998) reportan que las células de Salmonella
spp y S. typhimurium injuriadas mediante calor se tornan sensibles al desoxicolato,
agente selectivo empleado en el medio xilosa - lisina - desoxicolato (XLD). Las células injuriadas pierden su resistencia normal y se vuelven sensibles a muchos agentes químicos, además de perder compuestos celulares de bajo peso molecular hacia el medio. De esta forma se sugiere que la mayoría de estudios deben emplear medios nutritivos sin agentes selectivos para la recuperación de células injuriadas por tratamientos térmicos (Stephens et al., 1997; Boziaris et al., 1998).
6.4.1 Curva de muerte térmica en caldo BHI a pH 5.5
Por otra parte, el pH juega un papel fundamental como complemento para el calor en el desarrollo de las curvas de muerte térmica, viéndose disminuido drásticamente el tiempo requerido para la inactivación de Salmonella spp a temperatura de 80ºC
en caldo BHI ajustado a pH de 5.5 (figura 12), siendo en este estudio reducido a la mitad comparado con el caldo BHI a pH de 7.0.
Couvert et al., (1999) sugieren que una disminución en el pH del medio de
calentamiento y/o del medio de cultivo para la recuperación reduce la resistencia bacteriana al calor. Igualmente Leguérinel et al., (2007) han demostrado que un
tratamiento térmico para S. typhimurium a pH de 5 reduce el tiempo de
calentamiento en una proporción de 3.5 veces, o con el mismo tiempo de calentamiento, puede reducir la temperatura en 2.25ºC con la misma eficiencia letal. Esto se debe a que el pH ácido del medio altera el orden de los componentes de la membrana celular haciéndola más permeable y por ende más sensible a factores externos (Leguérinel et al., 2007). Del mismo modo, las alteraciones
conformacionales de proteínas y lipopolisacáridos (LPS) de la membrana externa durante un tratamiento térmico provocan un cambio en la estructura de la membrana
suministrado al microorganismo afecta de manera más directa el material intracelular denaturando e impidiendo la síntesis de nuevas proteínas.
Sin embargo, Doyle y Mazzotta (2000) reportan un incremento en la termorresistencia de S. enteritidis al disminuir el pH del medio con ácido láctico y
ácido cítrico, pero no al emplear ácido clorhídrico o acético pues se reduce el tiempo de exposición al calor necesario para la destrucción de la cepa, lo que demuestra que en este tipo de ensayos la termorresistencia esta asociada al tipo de ácido utilizado. De este modo, los ácidos inorgánicos al parecer disminuyen la termorresistencia de los microorganismos ya que penetran con mayor facilidad la pared celular alterando su conformación (Humphrey et al., 1995; Kinner & Moats,
1981).
6.4.2 Curvas de muerte térmica en caldo compost
Para esta parte se trabajó con caldo compost filtrado y sin filtrar a temperatura de 80ºC debido a que previamente se había logrado la inactivación total de la cepa a esta temperatura en caldo BHI.
Contrario a los esperado, el caldo compost filtrado presentó mejores condiciones para la supervivencia de Salmonella spp puesto que se logró recuperar la cepa
hasta los 105 minutos de tratamiento, en contraste con los 60 minutos obtenidos en el caldo sin filtrar (figura 13). Al no filtrar el caldo compost se pueden hallar partículas suspendidas de gran tamaño las cuales se esperaría le brindaran protección a la cepa durante el tratamiento térmico, pero contrario a esto, resulto ser un medio que no favorece el desarrollo de la termorresistencia de la cepa, posiblemente por la dificultad de la cepa para degradar las partículas de gran tamaño en busca de nutrientes, debido a que este microorganismo no presenta una maquinaria enzimática capaz de degradar sustratos complejos (Bertoldi et al., 2000).
Igualmente el gran tamaño de las partículas podría llegar a representar un impedimento en la migración de la célula por el medio de cultivo en busca del
desarrollar factores de termorresistencia como la síntesis de proteínas de choque térmico (HSP) o el reensamble de las partículas ribosomales la célula necesita de sustratos asimilables (Humpheson et al., 1998), por consiguiente, las partículas
suspendidas en el caldo compost sin filtrar podrían obstaculizar el acceso del microorganismo a los nutrientes de fácil metabolismo.
Caso contrario se presume podría suceder en el caldo compost filtrado, en donde el microorganismo puede llegar a entrar en contacto directo con la peptona de caseína y de esta forma incrementar la resistencia al calor.
Al comparar los resultados obtenidos en el caldo compost (filtrado – sin filtrar) con el caldo BHI (pH 7.0) se observa una gran diferencia, pues la cepa en estudio resistió 75 minutos más el tratamiento térmico a 80ºC en el caldo BHI respecto al caldo compost filtrado, y 120 minutos comparado con el caldo sin filtrar.
Por su parte, el caldo compost podría llegar a limitar el crecimiento y desarrollo normal de la cepa, debido a que se han reportado la presencia de sustancias antibacterianas, producidas por actinomycetes y hongos, y de compuestos tóxicos naturales formados durante el compostaje (Eklind et al., 2004). Igualmente, se han
hallado en muestras de compost sustancias fitotóxicas tales como taninos y polifenoles, clasificadas como inhibidores aleloquímicos, que muchas veces pueden actuar como atrayentes, estimulantes, toxinas, repelentes o inhibidores de crecimiento (Fan & Lou, 2004). De la misma forma, restos de enzimas bacterianas y ácidos húmicos encontrados en compost presentan cierto tipo de actividad antimicrobiana (Loffredo et al., 2007; Casulli & Sanesi, 2007), lo cual puede interferir
de manera directa en la baja termorresistencia exhibida por Salmonella spp en el
caldo compost, puesto que las células injuriadas en un tratamiento térmico son más sensibles ante cualquier sustancia antibacteriana (Ray, 1993).
6.5 Valor D
corresponde al comportamiento de la cepa una vez ha sufrido la injuria, mientras que en el valor DT se tienen en cuenta todos los valores obtenidos durante el
tratamiento térmico, es decir, antes, durante y después de sufrir injuria. Es por esto que el valor DT es menor en todos los tratamientos realizados a Salmonella spp,
excluyendo el ensayo a 50ºC en donde el comportamiento de los datos fue lineal decreciente y no presentó shoulders o tails (hombros o colas).
Las curvas de muerte térmica en este estudio presentaron un comportamiento bifásico caracterizado por shoulders u hombros al inicio y por una disminución lineal
en la población al final del tratamiento. La presencia de shoulders (hombros) en un
tratamiento térmico indica en la mayoría de los casos que la cepa sufre de injuria