Diseños experimentales

4.2.1. Estudio de la evolución del perfil carotenoide durante el desarrollo del grano y análisis de expresión de genes de la ruta de carotenogénicos.

Al objeto de progresar en el conocimiento del metabolismo carotenoide en vegetales abordando aspectos relacionados con la biosíntesis y acumulación de éstos, se analizó la evolución del contenido y composición de pigmentos carotenoides durante el desarrollo y maduración de los granos de ambos cereales, trigo duro y tritordeum, así como la expresión de los principales genes que codifican las enzimas implicadas en la carotenogénesis para correlacionar dichos niveles con el contenido de pigmentos observado a lo largo del desarrollo de los distintos granos. Para ello se diseñó un ensayo de campo completamente aleatorizado con 2 bloques (B1 y B2) por variedad (Trigo duro: Don Pedro, Simeto, Claudio,

Kofa y UC1113; Tritordeum: HT621, HT630, HT609, HT240 y HT335) (Figura 40). Esto experimentos se llevaron a cabo en las instalaciones del Instituto de Agricultura Sostenible (IAS-CSIC) de Córdoba, siendo coordinados por el Dr. Sergio G. Atienza. Cada genotipo estuvo representado por 1 surco con 10 plantas separadas 10 cm entre sí. Para cada genotipo se determinó la fecha de antesis y se dejó autopolinizar embolsando las espigas para evitar cualquier posibilidad de cruzamiento espontáneo. La toma de muestras se realizó, entre marzo y abril del 2010, sustrayendo los granos en desarrollo de la parte media central de la espiga. Se tomaron muestras a los 8, 14, 18 y 25 días después de la antesis (DDA). Las muestras fueron inmediatamente congeladas y almacenadas a -80°C hasta los posteriores análisis.

Control 0 DDA B loques E1 8 DDA B1 B2 Estadíos de desarrollo (DDA, días después de antesis)

E2 14 DDA E3 18 DDA E4 25 DDA EF 30 DDA

Figura 40. Diseño experimental para el análisis de evolución de pigmentos y expresión de genes carotenogénicos durante el desarrollo y maduración del grano. Dos bloques al azar por variedad (B1 y B2). Estadíos de desarrollo y maduración: E1 (8 DDA), E2 (14 DDA), E3 (18 DDA), E4 (25 DDA) y EF (maduro). Material vegetal: trigo duro (Don Pedro, Simeto, Claudio, Kofa y UC1113) y tritordeum (HT621, HT630, HT609, HT240 y HT335).

4.2.2. Evolución y estabilidad de pigmentos carotenoides durante el almacenamiento en postrecolección de granos maduros de trigo duro y tritordeum.

Al objeto de evaluar el efecto de las condiciones de almacenamiento (tiempo/temperatura) sobre el metabolismo de los pigmentos carotenoides durante el almacenamiento de granos en postcosecha, se dispuso de granos de tres variedades trigo duro (Don Pedro, Simeto y Claudio) y tritordeum (HT630, HT621 y HT609) recolectados inmediatamente tras alcanzar la total madurez (Figura 41). Los granos fueron dispuestos en tres bloques (B1, B2 y B3) por cada variedad, los cuales fueron mantenidos en cámara o

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estufas termostatizadas a 4, 20 y 37°C. El muestreo se realizó a los 0 (control), 30 (M1), 60 (M2) y 90 (M3) días. En cada muestreo, y para cada variedad, se retiró de cada bloque una cantidad aproximada de 15 gramos de granos, que fue conservada a -30°C hasta el posterior análisis. 4ºC 20ºC 37ºC Control to=0 B loques

Temperaturas _{M1 t=30 días M2 t=60 días}

B1

M3 t=90 días

B3 B2

Muestreos (tiempo)

Figura 41. Diseño experimental para el análisis de evolución de pigmentos carotenoides durante el almacenamiento en postcosecha de granos maduros. Tres bloques al azar por variedad (B1, B2 y B3). Temperaturas de almacenamiento: 4, 20 y 37°C. Muestreos: Control (0 días), M1 (30 días), M2 (60 días) y M3 (90 días). Material vegetal: trigo duro (Don Pedro, Simeto, Claudio) y tritordeum (HT621, HT630, HT609).

4.2.3. Estudio preliminar de evolución y estabilidad de pigmentos carotenoides durante el almacenamiento controlado de harinas integrales de trigo duro y tritordeum.

La harina constituye uno de los productos derivados de cereales más importantes en cuanto a sus múltiples aplicaciones. Por su extendido uso, resulta de especial interés conocer el efecto del almacenamiento sobre el contenido y perfil de pigmentos carotenoides en harinas mantenidas a diferentes temperaturas. Para tal fin se realizó un estudio preliminar empleando harinas integrales preparadas con los granos maduros utilizados para el estudio de almacenamiento en postrecolección de los mismos. Para la obtención de las harinas se utilizaron 50 gramos de granos de cada muestra, los cuales fueron molidos mediante un molino de martillo con un tamiz de salida de 2 mm. La harina se distribuyó en alícuotas de aproximadamente 1 gramo (anotando el peso exacto hasta el cuarto decimal) en el interior de tubos Falcon® de 15 mL que fueron dispuestas en gradillas situadas en el interior de cámaras o estufas termostatizadas a 4, 20, 37 y 50°C. Se tomaron 4 muestras control (tiempo=0 días) por variedad. Para cada variedad se dispuso un total de 24

muestras correspondientes a un demuestre mensual por duplicado a 30 (M1), 60 (M2) y 90 (M3) días sometidas a las temperaturas 4, 20, 37 y 50°C (Figura 42).

Control to=0

Temperaturas _{M1 t=30 días M2 t=60 días M3 t=90 días} Muestreos (tiempo)

4ºC

20ºC

37ºC

50ºC

Figura 42. Diseño experimental para el análisis de evolución y estabilidad de los pigmentos carotenoides durante el almacenamiento de harinas integrales de trigo duro y tritordeum. Temperaturas de almacenamiento: 4, 20, 37 y 50°C. Muestreos: Control (0 días), M1 (30 días), M2 (60 días) y M3 (90 días). Material vegetal: harinas de trigo duro (Don Pedro, Simeto, Claudio) y harinas de tritordeum (HT621, HT630, HT609).

4.2.4. Estudio de la evolución y estabilidad de los pigmentos carotenoides durante el almacenamiento prolongado (12 meses) de granos y harinas integrales de trigo duro y tritordeum.

Con el objetivo de investigar la evolución del contenido y composición de pigmentos carotenoides durante el almacenamiento de granos y harinas de trigo duro y tritordeum, así como evaluar el efecto de las condiciones impuestas sobre la estabilidad de los mismos y la cinética del proceso, se realizó un seguimiento de los pigmentos carotenoides presentes en granos y harinas durante un periodo de 12 meses. El experimento se realizó con granos de la variedad Don Pedro de trigo duro y HT621 de tritordeum. Al objeto de asegurar la total madurez de los granos se seleccionaron semillas correspondientes a campañas anteriores. En este sentido, los granos de trigo duro (Don Pedro) correspondían a la campaña 2006/2007 y los de tritordeum (HT621) al año 2008, habiendo estado conservados a 4°C hasta la puesta en marcha de los experimentos. Para ambas variedades se prepararon las correspondientes harinas integrales (aproximadamente 300 gramos) empleando un molino de bolas Retsch modelo MM400 (condiciones de molienda: 2 bolas de acero de 15 mm de diámetro, 25 HZ de frecuencia y 1 minuto de tiempo de molienda). Tanto los granos como

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las harinas fueron distribuidos en alícuotas de aproximadamente 4 gramos en el interior de tubos Falcon® de 15 mL que fueron dispuestas en gradillas situadas en el interior de cámaras o estufas termostatizadas a -32, 6, 20, 37 y 50°C, siendo dicha cantidad suficiente para realizar un análisis por triplicado de cada muestra (1 g de grano o harina por análisis). Se tomaron 5 muestras control (tiempo=0 días) por variedad. Para cada variedad y tipo de muestra (granos y harinas) se dispuso un total de 180 muestras correspondientes a un demuestre mensual por triplicado a 30 (M1), 60 (M2), 90 (M3), 120 (M4), 150 (M5), 180 (M6), 210 (M7), 240 (M8), 270 (M9), 300 (M10), 330 (M11) y 360 (M12) días sometidas a las temperaturas -32, 6, 20, 37 y 50°C Las muestras fueron congeladas a -80°C hasta su procesamiento y análisis, En las Figuras 43 y 44 se describen los correspondientes diseños experimentales. Durante el transcurso de la experiencia se realizó un seguimiento continuo de las temperaturas de almacenamiento, registrándose con una frecuencia de días alternos.

Control

to=0

Temperaturas M1 t=30 días M2 t=60 días M3 t=90 días

Muestreos (tiempo) -32ºC 6ºC 20ºC 37ºC 50ºC M12 t=360 días

Figura 43. Diseño experimental para el análisis de evolución y estabilidad de los pigmentos carotenoides durante el almacenamiento de granos de trigo duro (variedad Don Pedro) y tritordeum (línea HT621). Temperaturas de almacenamiento: -32, 6, 20, 37 y 50°C. Muestreos: Control (0 días), 30 (M1), 60 (M2), 90 (M3), 120 (M4), 150 (M5), 180 (M6), 210 (M7), 240 (M8), 270 (M9), 300 (M10), 330 (M11) y 360 (M12).

Control

to=0

Temperaturas _{M1 t=30 días M2 t=60 días M3 t=90 días}

Muestreos (tiempo) -32ºC 6ºC 20ºC 37ºC 50ºC M12 t=360 días

Figura 44. Diseño experimental para el análisis de evolución y estabilidad de los pigmentos carotenoides durante el almacenamiento de harina integrales de trigo duro (variedad Don Pedro) y tritordeum (línea HT621). Temperaturas de almacenamiento: -32, 6, 20, 37 y 50°C. Muestreos: Control (0 días), 30 (M1), 60 (M2), 90 (M3), 120 (M4), 150 (M5), 180 (M6), 210 (M7), 240 (M8), 270 (M9), 300 (M10), 330 (M11) y 360 (M12).