Estrategias para mejorar el contenido y composición de

La mejora vegetal moderna ha incrementado con éxito la productividad, al conseguir un mayor rendimiento y una mejor adaptación de los cultivos a estrés biótico y abiótico siendo éste su propósito inicial. Sin embargo, los programas dirigidos a potenciar los niveles de fitoquímicos con efectos saludables, tales como carotenoides, son de desarrollo muy reciente (Welch y Graham, 2002; 2004). La mejora convencional, en este sentido, se nutre de la variabilidad natural del contenido carotenoide de los cultivos así como de la búsqueda de variantes alelicas y mutantes específicos con propiedades carotenogénicas de interés (Li et al., 2001; Farré et al., 2010a). Dicha variabilidad genética se organiza en locus de caracteres cuantitativos (QTLs, Quantitative Trait Loci). La siguiente estrategia es

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desarrollar métodos de selección de alelos favorablespara confeccionar líneas mejoradas del cereal que porten dicho alelos y detectar QTLs capaces de explicar gran parte de la variabilidad observada en la población. La mejora vegetal comprende cualquier forma de mejora que no incluya la introducción de nuevo material genético usando tecnología recombinante. No obstante, emplea el uso de marcadores moleculares para facilitar estrategias de selección, mutación acelerada o métodos de hibridación forzada para la introgresión de genes desde parentales distantes lo cual similarmente tampoco ocurre en la naturaleza (Bai et al., 2011). Un buen referente en la bibliografía sobre la aplicación de estas herramientas y cómo han evolucionado hasta el presente se encuentra en el fruto del tomate (revisado por Foolad, 2007). La exploración del genoma de las especies vegetales y su divergencia se realiza desde tres perspectivas: la genómica comparativa empleando especies modelo, la genómica estructural y la genómica funcional (Varshney et al., 2006).

La introgresión consta de dos pasos: hibridación sexual para integrar el genoma silvestre hacia el fondo genético de la especie cultivada de interés, y recombinación homóloga y/o homoeóloga para eliminar o reemplazar los alelos deletéreos y/o genes innecesarios que van asociados al locus seleccionado. Sin embargo, dicho proceso de eliminación es tedioso y costoso, por lo que este aspecto ha limitado en cierta medida el uso de especies silvestres en los programas de mejora (Feuillet et al., 2007). Existen muchos factores que influyen en el éxito de estos procesos, y que no son más que un reflejo de la distancia evolutiva que separa las especies que participan.

La construcción de mapas genéticos con marcadores moleculares ha sido uno de las herramientas más utilizadas. Entre las distintas clases de marcadores destacan los basados en secuencias de repetición única o microsatélites (SSR, simple sequence repeat) y los de polimorfismo de un único nucleótido (SNP, single-nucleotide polymorphism), ambos muy abundantes en el genoma. Además se utilizan los marcadores generados a partir de regiones transcritas del genoma, los denominados marcadores funcionales (FM,

functional markers.), debido a que la posible función de un determinado gen puede ser deducida por tales marcadores (Varshney et al., 2006). La mejora convencional puede ser acelerada en este sentido por la selección asistida por marcador (MAS, Marker Assisted Selection) (Ribaut y Hoisington 1998). Esto resulta especialmente útil cuando se trabaja con caracteres cuantitativos, siendo la actividad de múltiples genes los que contribuyen a un único fenotipo. Esto ha permitido finalmente mapear QTLs. Una estrategia para identificar marcadores moleculares para su posterior uso en MAS es el mapeo por asociación. Se basa en poder encontrar asociaciones no al zar entre marcadores, genes y locus de atributos cuantitativos (Flint-García et al., 2003). El uso de estos marcadores también se

emplea los marcadores moleculares para confeccionar mapas genéticos alrededor de una región que alberga un gen de interés, para finalmente mediante mapa físico aislar el gen (Varshney et al., 2006).

La mutagénesis también permite acelerar estos procesos generando nuevos alelos. La radiación con rayos X o el empleo de mutágenos químicos puede son los medios más habituales para tal fin. Cualquier efecto fenotípico de dichas mutaciones será observado en la siguiente generación, si es de carácter dominante, lo cual deberá ser mapeado para identificar el gen afectado. Una estrategia mejorada en este sentido es el método TILLING (Targeting Induced Local Lesions In Genomes). Se trata de un método que permite introducir, inicialmente mediante tratamiento con un mutágeno, mutaciones o variaciones genéticas nuevas en genes que afectan a un carácter de interés. Posteriormente se rastrea las variaciones mediante PCR diseñando primers (cebadores) específicos para amplificar un único gen de interés etiquetado de esta forma. Con este método es posible identificar variación genética a nivel de un par de bases (Slade y Knauf, 2005; Comai y Henikoff, 2006).

Así el desarrollo de poblaciones de introgresión, secuenciación de genomas y la mejora asistida por marcadores moleculares (Gupta et al., 1999; Zamir, 2001; Liu et al.,

2003b) han supuesto los avances más notables. Sin embargo, estos procesos de selección de QTLs, aunque son agilizados por las técnicas anteriores citadas, siguen siendo lentos y restrictivos al conjunto génico ya existente en el cultivo, es decir, no permite cambios en el perfil cualitativo de pigmentos característico del vegetal.

La ventaja de la ingeniería genética incluye la habilidad de transferir genes de una manera más rápida y dirigida con la posibilidad de la introducción de material genético desde diversas plantas y especies no relacionadas tales como microorganismos (Sandmann, 2001b; Giuliano et al., 2008; Fraser y Bramley, 2009). Entre los avances más recientes destacan el uso de vectores y protocolos de transformación plastídicos cada vez más eficientes (Wurbs et al., 2007). Cultivos populares en este campo como tomate, patata y arroz cuentan con diversos ejemplos en la literatura en donde se emplean diseños experimentales dirigidos a realizar ingeniería cualitativa, cuantitativa y pleiotrópica de la carotenogénesis (Ye et al., 2000; Dharmapuri et al., 2002; Römer et al., 2002; Davuluri et al., 2005; Ducreux et al., 2005; Gerjets y Sandmann, 2006). La ingeniería cualitativa implica la generación de una nueva composición de pigmentos en el cultivo siendo quizás la estrategia más llamativa e implicando generalmente construcciones multigénicas. Su ejemplo más conocido y de mayor impacto mediático es el Golden Rice (Figura 37), el cual ha supuesto un avance importante en la mejora nutricional de alimentos básicos (Ye et al.,

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2000; Beyer et al., 2002). La ingeniería cuantitativa o aumento de carotenoides se centra en incrementar el flujo a través de la ruta ya existente en el vegetal. El incremento de precursores o la muy generalizada sobreexpresión del gen psy (Burkhardt et al., 1997; Shewmaker et al., 1999; Fraser et al., 2002) suelen ser las estrategias más empleadas. Ésta última, en algunas ocasiones, deriva en un cambio además en la proporción de pigmentos que se acumulan, lo cual encierra una alteración de las actividades enzimáticas relativas de etapas más posteriores en la biosíntesis de carotenoides (Ravanello et al.,

2003). En ocasiones la táctica a emplear implica a una enzima, proteína reguladora o estructural de otra ruta o proceso biológico el cual no está directamente concursando en la biosíntesis de carotenoides (ingeniería pleiotrópica). Esto hace que tanto el diseño experimental como el control de los resultados sea complicado. Una de las herramientas más utilizadas por esta última es la tecnología de RNAi o silenciamiento (Davuluri et al.,

2005; Wei et al., 2009).

Figura 37. Granos de arroz tradicional y de Golden Rice 2.

Un efecto observado con frecuencia al desarrollar estas manipulaciones de la carotenogénesis ha sido la alteración a nivel de capacidad de almacenamiento de los carotenoides, por tanto de su acumulación, provocado por la diferente naturaleza de los nuevos pigmentos o por el contenido de los mismos que se genera en el tejido vegetal modificado (Stalberg et al., 2003; Jayaraj et al., 2008; Maass et al., 2009). Esto ha llevado al desarrollo de nuevas estrategias basadas justamente en alterar la capacidad de retención o deposición de éstos (Li y Van Eck, 2007). Dichas investigaciones se centran en trabajar con los dos genes identificados hasta el momento que median la acumulación de los pigmentos en plantas, el gen Or y el gen de fibrilina (Lu et al., 2006; Lopez et al.,

2008b), así como los que codifican para las enzimas CCD implicadas en el catabolismo carotenoide (Ohmiya et al., 2006).

No obstante, en la actualidad siguen existiendo obstáculos para un desarrollo y resultados completamente óptimos de dichas técnicas. Desde un punto de vista nutricional la principal desventaja de los cultivos modificados genéticamente de segunda generación reside en la falta de aceptación por el consumidor de estos nuevos alimentos en el mercado (Potrykus, 2001; Bouis et al., 2003; Farré et al., 2010b). La alteración de otras rutas adyacentes en el entramado metabólico isoprenoide y el conocimiento limitado de la regulación de la expresión de los genes carotenogénicos endógenos paralelos a los foráneos son los más relevantes desde una perspectiva técnica (Sandmann, 2001b). Así algunos resultados inesperados como los obtenidos por Botella-Pavía et al. (2004), Ralley

et al. (2004), Enfissi et al. (2005), pueden ser producidos por una elección errónea del tejido, del promotor o del gen/cDNA. Los requisitos por tanto generales para un aumento eficiente en carotenoides pasa por asegurar el adecuado suministro de precursores, mantener el balance con las rutas metabólicas con las que se encuentra en conexión y que el lugar de acumulación diana sea eficiente en el almacenaje de los carotenoides generados.

2.2.6.2. Aplicaciones de la biotecnología de carotenoides en cereales.

La biotecnología como técnica de mejora vegetal aplicada al aumento del contenido de carotenoides en cereales ha sido utilizada fundamentalmente con tres especies, maíz, trigo y sorgo. La relevancia de estos cereales y su impacto en la nutrición de poblaciones

desfavorecidas quedan patentes en programas de biofortificación como el de Harvestplus

perteneciente al Consultive Group on International Agricultural research (CGIAR) centrado en el aumento de hierro, zinc y provitamina A de cultivos básicos (http://www.harvestplus.org/).

El avance en la exploración de los genomas de los principales cereales como el trigo ha sido gracias a la existencia de modelos genómicos como el arroz y el sorgo de los

cuales se dispone la secuencia completa de sus genomas (Paterson et al., 2009; Mace y

Jordan, 2011). Gran parte de la investigación se ha basado en primer lugar en estudiar la viabilidad del rasgo susceptible a ser mejorado de forma convencional, es decir la variabilidad para el contenido carotenoide en una población dada. Así como la heredabilidad del mismo que ha sido apuntada como alta (Santra et al., 2005; Clarke et al.,

2006). Los genomas de maíz, sorgo y trigo han demostrado presentar una diversidad genética importante para este carácter, como así lo refleja la existencia de germoplasmas

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de elite de dichas especies (Chander et al., 2008b; Ibrahim y Juvik, 2009). Hasta la actualidad el estudio se ha centrado en la detección de QTLs, existiendo numerosos trabajos que describen la identificación de dichos locus y su relación con la variación fenotípica en el contenido carotenoide del endospermo de cereales (Wong et al., 2004; Pozniak et al., 2007; Chander et al., 2008b; Patil et al., 2008; Salas-Fernández et al., 2008). La investigación a este nivel va más allá de la justificación del contenido carotenoide global identificándose QTLs especifícos para carotenoides específicos como luteína y β-caroteno. Salas-Fernández et al. (2008) detectan en sorgo cinco QTLs sobre los cromosomas 1, 2, y 10 para β-caroteno. Howitt et al. (2009) identifican tres QTLs para el contenido de luteína sobre los cromosomas 3B, 5B y 7A de trigo duro. Así como más recientemente Blanco et al.

(2011) obtienen en el mismo cereal QTLs tanto para β- como α-caroteno en los cromosomas 2A, 3B y 7A. En trigo los QTLs más determinantes para el contenido en pigmentos han sido repetidas veces mapeados sobre los cromosomas 7A y 7B, tanto en trigo duro como harinero. Los genes que codifican para PSY1 generalmente cosegregan con esos QTLs. Las variaciones alélicas de esos genes son numerosas y la aparición continua de nuevos alelos resulta muy probable. Esto demuestra un alto nivel de polimorfismo genético así como mucha genómica por explorar (Ravel et al., 2013).

Como se introdujo con anterioridad, una de las grandes estrategias en mejora vegetal es la búsqueda de nuevas fuentes de variación en especies relacionadas. En este caso particular podemos citar Lophopyrum ponticum (Zhang et al., 2005) y H. chilense

(Rodríguez-Suárez et al., 2011b; Rodríguez-Suárez y Atienza, 2012). H. chilense, cuyos pequeños granos se caracterizan por presentar un nivel de carotenoides alto, presenta al menos dos locis para el contenido de pigmentos ubicados en los cromosomas 2Hch _{y 7H}ch (Álvarez et al., 1998, 1999b; Atienza et al., 2004, 2008). El conocimiento de la localización cromosómica de estos genes fue primero estudiado por Álvarez et al. (1998) usando líneas de adición de H. chilense en trigo. Estos autores localizaron genes responsables del nivel

de pigmentos (medido como YPC) en H. chilense sobre el cromosoma 7 y mapearon este

rasgo sobre el brazo α de dicho cromosoma. Sin embargo la posibilidad de la interacción entre genes de H. chilense y los del trigo, en tritordeum que podrían llevar a ocultar la existencia de otros genes responsables de la regulación de pigmentos, propició la búsqueda de nuevos locus en el genoma de esa especie. Posteriormente, mediante la construcción del primer mapa genético de H. chilense (Hernández et al., 2001b), derivó en la identificación de un nuevo QTL sobre el cromosoma 2 denominado carot 1 (Atienza et al., 2004). Actualmente la generación de mapas de mayor cobertura para dicha especie con estos fines están ya disponibles (Rodríguez-Suárez et al., 2012) lo que genera una mayor probabilidad de encontrar regiones genómicas de interés en H. chilense. Estos datos

constituyen los primeros pasos hacia el desarrollo de un programa de MAS para el contenido de carotenoides en Tritordeum, lo cual es interesante para la transferencia de genes determinantes de un mayor contenido en carotenoides, desde Tritordeum a líneas de trigo sometidas a programas de mejora. De este modo, el anfiploide Tritordeum también se convertiría en una especie útil para la mejora de cereales actuando como especie puente entre la cebada y el trigo (Álvarez et al., 1999b; Martín et al., 1999; Atienza et al., 2005,2007a, 2007c).

Las líneas de Tritordeum, independientemente del nivel de ploidía, muestran niveles de carotenoides bastantes más altos que sus parentales de trigo. Debido a eso una de las líneas de investigación más extendida ha sido estudiar la variación genética de este rasgo en tritordeum y su relación con el nivel de pigmentos de ambas especies parentales, H. chilense y trigo. De estos estudios se desprende que aunque el genoma Hch _{es claramente} responsable de dicho nivel de pigmentos en tritordeum, pueden existir interacciones entre los sistemas genéticos de ambas especies parentales que no deben obviarse (Álvarez et al., 1999b).

La utilidad de la ingeniería metabólica para mejorar la nutrición humana alcanza sus mejores propósitos en el campo de los alimentos básicos (Staple Foods) donde, no cabe duda que, el impacto en poblaciones de bajos recursos puede ser máximo. La generación de nuevos cultivos con la etiqueta Golden como Golden Potato o Golden Canola son cada vez más numerosos sumándose al bien conocido Golden Rice (Beyer, 2010; Bai et al.,

2011). En cereales es justamente el éxito de éste último el que ha llevado a la manipulación de otras especies. La intensa investigación desde los primeros intentos realizados con dicho cultivo por Burkhardt et al. (1997) hasta los más recientes con la generación del

Golden Rice 2 (Paine et al., 2005) ha proporcionado ideas para tal fin. La expresión del gen

y1 de maíz en el endospermo de trigos harineros hexaploides constituye un ejemplo (Cong

et al., 2009). El maíz también cuenta con algunos ensayos al respecto. La utilización mejorada del promotor γ-zein (Marzábal et al., 1998), altamente específico para la expresión en tejido endospermico (super γ-zein) se tradujo en un aumento de carotenoides totales de hasta 34 veces con una acumulación preferencial en el mismo de β-caroteno (Aluru et al., 2008). Una estrategia más compleja fue ideada por Zhu et al. (2008) mediante la generación de toda una batería de plantas transgénicas de maíz que resultaron de las múltiples combinaciones posibles fruto de una trasformación multigénica. Más recientemente el aumento simultáneo en el contenido en tres vitaminas, implicando la manipulación así de tres rutas metabólicas distintas (Naqvi et al., 2009), coloca al maíz como un cultivo prometedor para potenciar en carotenoides provitamina A, mostrando menos restricciones que otros como arroz o trigo (Wurtzel et al., 2012). Las investigaciones

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más recientes con Golden Rice se centran ahora en el estudio de la estabilidad y trasferencia de los transgenes para la obtención de cultivares de arroz con un mayor rendimiento mediante introgresión y otras técnicas de mejora (Datta et al., 2006; 2007). Otros granos minoritarios como sorgo y mijo, pero también con un gran impacto en poblaciones de bajos recursos como la africana, están adaptándose cada vez más a estas técnicas haciéndose un hueco en la biofortificación mediada por manipulación genética (O’Kennedy et al., 2006; www.grandchallenges.org/ImproveNutrition/Challenges/Nutrient RichPlants/Pages/ Sorghum).