LOS DOMINIOS TRANSMEMBRANA

Los dominios transmembrana (TMD) de las glicoproteínas de la envoltura viral E1 y E2 son esenciales para la unión a la membrana de dichas proteínas [162], la retención de las mismas en el retículo endoplásmico [163, 164] así como para la formación de heterodímeros funcionales E1E2 [165, 166].

Cada uno de estos dominios TMD consiste en dos hebras hidrofóbicas separadas por una serie de residuos polares altamente conservados [167] actuando la segunda de ellas como péptido señal para la liberación de la proteína situada a continuación en la poliproteína [121]. Así, el dominio transmembrana de E1, residuos 353-383 de la poliproteína, está compuesto por dos tramos de residuos hidrofóbicos conectados por un corto segmento hidrofílico, residuos 367-370, en el que hay un residuo de Lys370 totalmente conservado. Por su parte, el dominio transmembrana de E2, residuos 716-746, posee una organización a nivel de secuencia similar a la de E1, con dos residuos cargados altamente conservados, Asp728 y Arg730, en el segmento de conexión entre las dos regiones hidrofóbicas.

El segundo tramo de residuos hidrofóbicos de los TMD de ambas proteínas contiene la secuencia señal de corte por proteasas para la liberación de la siguiente proteína. Así, los residuos 370-383 de E1 actúan como secuencia de corte para E2 y los residuos 730-746 de E2 actúan como secuencia señal para el procesamiento de p7. Así mismo, son los 14 últimos residuos de C los encargados de actuar como señal para la

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liberación de E1 [121]. Los cortes proteolíticos se producen entre los residuos 191/192, 383/384 y 746/747, respectivamente [168-170] (figura 11).

Figura 11. Representación esquemática de la estructura de los dominios transmembrana (TMD) de las glicoproteínas E1 y E2. A) Esquema de la poliproteína del HCV. Tras el procesamiento por la peptidasa señal (flechas), las glicoproteínas de la envoltura son liberadas. Sp1, Sp2 y Sp7 son las secuencias señal de E1, E2 y el pequeño polipéptido p7 respectivamente. B) Secuencias y organización de los TMD de E1 y E2. Los aminoácidos que corresponden al dominio transmembrana están subrayados, apareciendo en negrita los residuos polares altamente conservados en ambas proteínas. Las posiciones indicadas para los aminoácidos corresponden a su posición en la poliproteína para la cepa H77. Adaptada de [121].

En cuanto a la arquitectura de estos dominios en la membrana, se ha descrito la expresión, por separado, de los dominios transmembrana de E1 y E2 unidos a una proteína de unión a maltosa (MBP) y reconstitución en micelas con diversas composiciones lipídicas así como la caracterización por métodos de resonancia magnética nuclear (RMN) [171, 172]. Estos experimentos han revelado que el dominio transmembrana de E1 es capaz de adquirir, en micelas de SDS, una estructura plegada en la cual dos hélices α, conteniendo los residuos 354-363 y 371-379 estarían separadas por un segmento más flexible que comprende los residuos 364-370. En cambio, para micelas compuestas por LPPG, el fragmento flexible sólo comprendería los residuos 366-368 [172]. En cuanto al dominio transmembrana de E2, la estructura en micelas de LPPG comprende dos hélices formadas por los residuos 717-726 y 732- 746 donde los residuos 727-731, que incluyen los dos aminoácidos cargados, quedarían en forma lineal flexible en una disposición cercana a la cabeza polar del fosfolípido para proporcionar un entorno menos hidrofóbico a sus cargas [171]. En ambos casos, la disposición observada en la membrana requiere la ruptura de la hélice en dos tramos, separados por un segmento flexible que permitiría la permanencia de toda la secuencia dentro de la membrana en una estructura no lineal (figura 12).

C-terminal proteína C

Región TM de E1

Corte por la peptidasa señal Región TM de E2

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Figura 12. Representación de los resultados obtenidos para la reconstitución del dominio transmembrana de E1 (A) y E2 (B) en micelas de LPPG. Las hélices son representadas como cilindros mientras que las regiones flexibles o no estructuradas se representan por líneas cuyo grosor varía según el nivel de flexibilidad. Se muestran numerados los residuos que constituyen cada región del dominio transmembrana según esta predicción. Adaptadas de [172] (A) y [171] (B).

El estudio de la interacción que se produce entre estos dos dominios transmembrana ha resultado importante para tratar de dilucidar los mecanismos implicados en la formación de heterodímeros E1E2 [124, 125, 164, 165, 173]. Se han descrito dos aspectos claves en esta interacción: 1) La participación de residuos cargados de ambos dominios y 2) La presencia del motivo GXXXG en E1.

1) Los residuos cargados presentes en los dominios transmembrana fueron descritos como claves para la retención de las proteínas en el retículo ya que las proteínas mutadas en dichos residuos alcanzaban la membrana [167]. Sin embargo, la sustitución de estos residuos cargados por alaninas impide la heterodimerización de E1 y E2 [167]. A este respecto, se ha postulado la posibilidad de que se forme un puente salino entre ambas glicoproteínas [173]. De este modo, la Lys370 de E1 y el Asp728 de E2 formarían un puente salino que, por un lado, estabilizaría la interacción entre ambas proteínas y, por otro, neutralizaría las cargas en el interior de la membrana. Si esto fuera así, la Arg730 de E2 quedaría hacia el exterior de la interacción, de cara a los lípidos. Sin embargo, estudios de modelaje llevados a cabo por dinámica molecular (MD, del inglés “Molecular Dinamics”) proponen que la mutación de la Lys370 por alanina no resulta en una pérdida de heterodimerización, debido a que el Asp728 es capaz de establecer contactos estables con la Arg730 dirigiéndola hacia la interfaz hélice-hélice y permitiendo la interacción con la Asn367 de E1 siendo capaces de formar un puente de hidrogeno que estabilizaría la formación de dímeros. Sin embargo, si es el Asp728 el que es mutado por alanina, no se produce la rotación de la Arg730 anulándose la formación del heterodímero [174]. En la figura 13 se muestra una representación por MD de este proceso.

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Figura 13. Captura final de la simulación por dinámica molecular para los mutantes A) K370A y B) D728A. Los residuos diferentes al mutado se muestran según su orientación relativa. La mutación de K370A produce una alteración en el plegamiento de E2 para permitir la orientación de R730 hacia la cara interna de la hélice. Adaptada de [174].

2) La presencia de un motivo GXXXG típico de las interacciones entre hélices α ha sido descrita también como un motivo de heterodimerización. Este motivo implicaría las glicocolas en posiciones 354 y 358 de E1. Estos residuos quedarían hacia el mismo lado de la hélice (figura 14) por lo que podrían estar implicados en la interacción entre E1 y E2 [174]. La sustitución de estos residuos por triptófano supone una disminución de la heterodimerización [173] que llega a ser total al eliminar la Gly en posición 358. La inserción de alaninas a lo largo de la secuencia también deriva en una disminución o incluso anulación de la heterodimerización cuando se altera el motivo GXXXG [165].

Figura 14. Representación esquemática de la disposición de los residuos en la hélice formada por el dominio transmembrana de E1. Esquema de líneas en el cual se recrea la disposición espacial de los diferentes residuos del dominio transmembrana de E1 en la hélice α. Se aprecia la presencia de los dos residuos de glicocola, implicados en la formación del motivo GXXXG de interacción, en la misma cara de la hélice. Adaptada de [165].

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En definitiva, los estudios llevados a cabo sobre los residuos implicados en la interacción de los dominios transmembrana no permiten, hasta el momento, concluir cuáles de estos residuos realmente intervienen en la estabilización del heterodímero y cuál es la verdadera orientación de los dominios transmembrana en el interior de la bicapa, pudiendo ser esta orientación flexible adaptándose a la diferente polaridad del medio. Además, pese a haberse definido los residuos 353 de E1 y 712 de E2 como los iniciales de los dominios transmembrana, no existe ninguna evidencia experimental de cuál es la posición real que ocupan dichos segmentos con respecto a la bicapa lipídica.