ESTUDIOS DE INTERACCIÓN CON LÍPIDOS

4.12.1. PREPARACIÓN DE VESÍCULAS DE FOSFOLÍPIDOS

En los ensayos llevados a cabo se utilizó fosfatidilglicerol de huevo (PG). El fosfolípido se disuelve en cloroformo:metanol (2:1) formándose la película lipídica mediante la evaporación del disolvente orgánico bajo corriente de nitrógeno y posterior secado a vacío. A continuación se hidrata la película durante 1 h en el tampón correspondiente. Esta hidratación se realiza en baño a 37 oC, con agitación vigorosa en vortex cada 10 min. A continuación, la suspensión se sonica en un sonicador de baño (Branson 1200, Bransonic, Conneticut, USA) y se somete a un mínimo de quince etapas de extrusión en el dispositivo LiposoFastTM-Basic (Avestin), a través de filtros de policarbonato de 100 nm de tamaño de poro conocido (Avestin).

4.12.2. VALORACIÓN DE FÓSFORO

La concentración de fosfolípido de las diferentes muestras se ha determinado mediante la cuantificación del fósforo, siguiendo el método descrito por Barlett [340]. El reactivo de Fiske-Subbarow es una disolución de 6.25 mg de ácido 1-amino-2-naftol- 4-sulfónico y 5 g de bisulfito sódico en 25 ml de agua destilada. La reacción se basa en la reducción del molibdeno hexavalente del complejo fosfomolibdato amónico, obtenido por la reacción en medio ácido entre el fosfato inorgánico y el molibdato amónico, por el reactivo de Fiske-Subbarow para formar un complejo de color azul. A la muestra a valorar se le añaden 0.3 ml de ácido sulfúrico, dejando la disolución 2 h a 190-200 oC. Tras enfriar, se añaden 2-3 gotas de peróxido de hidrógeno. Se agita y se deja 2 h a 190-200 oC. Posteriormente, la muestra se diluye con 0.3 ml de agua destilada y se añaden 0.2 ml de molibdato amónico y 0.2 ml del reactivo de Fiske- Subbarow. Se agita y se deja a 80-90 oC hasta la aparición de color azul. Se mide la absorbancia a 830 nm y los valores obtenidos se interpolan en la recta de calibrado obtenida a partir de disoluciones de KH2PO4, con cantidades comprendidas entre 50 y

1000 ng de fósforo.

4.12.3. ENSAYO DE AGREGACIÓN DE VESÍCULAS DE FOSFOLÍPIDOS

La agregación de vesículas de fosfolípidos se ha caracterizado siguiendo el incremento en densidad óptica a 360 nm inducido por la adición de las proteínas a una preparación de vesículas lipídicas. A esta preparación, a una concentración final de 0.14 mM, se le añaden diferentes concentraciones de proteína y se registra la DO360 a

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lo largo del tiempo durante la incubación a 37 oC. Una vez que se alcanza el valor máximo, tras 15 min de incubación, se mide A360 con el fin de obtener las medidas

puntuales. Todas las medidas se realizaron en un espectrofotómetro DU-640 (Beckman). En todos los casos se realizan controles de vesículas en ausencia de proteína. El tampón empleado fue Medium Buffer ajustado a diferentes valores de pH según se indique en cada caso.

4.12.4. ENSAYO DE MEZCLA DE LÍPIDOS

Para seguir la adhesión y fusión de membranas inducidas por la proteína se recurre al ensayo clásico de transferencia de energía entre un par dador-aceptor, incorporados en una matriz lipídica, que se encuentren a la distancia adecuada [341]. En este ensayo es posible cuantificar la transferencia de energía por resonancia entre el dador N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il) fosfatidiletanolamina (NBD-PE) y el aceptor N-(lisamina) rodamina B sulfonil fosfatidiletanolamina (Rh-PE), incorporados en la bicapa del liposoma.

Se preparan dos tipos diferentes de vesículas, marcadas que contienen un 1% (p/p) de NBD-PE y un 0.8% (p/p) de Rh-PE, y vesículas sin marcar. Todas las suspensiones de vesículas se preparan a una concentración final de lípido de 1 mg/ml en Medium Buffer al valor deseado de pH. A continuación, se mezclan las vesículas marcadas y sin marcar en una proporción 1:9, manteniendo una concentración final de lípido de 1 mg/ml. Esta preparación de vesículas se diluye, a continuación, hasta una concentración de 0.1 mg/ml de lípido a la cual se realizan los ensayos, se añaden diferentes concentraciones de proteína y se incuba a 37 oC durante 1 h. La longitud de onda de excitación empleada es de 450 nm. La fusión de las vesículas marcadas y sin marcar se pone de manifiesto por el aumento de la emisión del NBD-PE a 530 nm y la disminución de la emisión de la Rh-PE a 590 nm. En todos los casos se mantienen rendijas de excitación y de emisión constantes a 4 nm. El polarizador de emisión se mantiene a 90o y el de excitación a 0o. La eficiencia de la transferencia de energía por resonancia (%RET) se calcula como la relación entre las intensidades de fluorescencia a 590 y 530 nm, utilizando la curva de calibrado apropiada y obtenida a partir de vesículas marcadas que contienen un 1% de NBD-PE y una concentración de Rh-PE variable entre 0 y 1%, teniendo en cuenta que:

%RET = [1 - (F/Fo)] × 100

siendo:

F: intensidad de fluorescencia a 530 nm de vesículas con un 1% de NBD-PE y un 0-1% de Rh-PE.

100

Fo: intensidad de fluorescencia a 530 nm de vesículas marcadas que contienen

un 1% de NBD-PE y un 0% (p/p) de Rh-PE.

En todos los casos, tras la adición de la cantidad correspondiente de proteína, se mide la emisión de fluorescencia a 590 nm en función del tiempo. Una vez que se estabiliza la medida, se registra el espectro de emisión de fluorescencia de la mezcla.

4.12.5. ENSAYO DE LIBERACIÓN DE CONTENIDOS ACUOSOS

El ensayo de liberación del contenido acuoso de los liposomas se lleva a cabo mediante la coencapsulación del fluoróforo ácido 8-aminonaftaleno 1,3,6-trisulfónico (ANTS), a una concentración 12.5 mM, y el apagador colisional bromuro de N,N’-p- xileno-bis-piridinio (DPX), a una concentración 45 mM, en Medium buffer al pH que se indique [342]. Las vesículas se hidratan en dichos tampones al pH deseado y, tras un proceso de sonicación, se someten a 5 ciclos de congelación en nitrógeno líquido/descongelación a 37 oC. A continuación se someten a extrusión como se ha indicado anteriormente. El material que no queda encapsulado se separa de las vesículas mediante una cromatografía de penetrabilidad en una columna de Sephadex G-75 (Pharmacia) de 10 x 2 cm. Como tampón de incubación se usa Medium Buffer al pH que se indique. Los ensayos se realizan a una concentración de fosfolípido de 0.1 mg/ml (0.14 mM), añadiendo diferentes concentraciones de proteína e incubando a 37

o

C durante 1 h. El valor de 100% de liberación se obtiene mediante adición de Triton X-100 al 0.5%, siendo el valor de 0% el obtenido al añadir tampón. Se emplea una longitud de onda de excitación de 385 nm y de emisión de 520 nm. Se sigue la cinética del proceso mediante la medida de la intensidad de fluorescencia a 520 nm en función del tiempo, siempre a una temperatura de 37 oC y con agitación. El parámetro %Fmáx

se obtiene de la siguiente ecuación:

siendo:

IFprot la intensidad de fluorescencia, una vez estabilizada, tras la adición de la

proteína.

IF0 la intensidad de fluorescencia inicial, antes de añadir la proteína.

IFTriton la intensidad de fluorescencia, una vez estabilizada, tras la adición de

Triton X-100.

Todas las intensidades de fluorescencia se corrigen teniendo en cuenta la dilución que se produce cuando se añade el Triton X-100.

IFprot– IF0 %Fmáx=

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4.13. ESTUDIO DE LA INTEGRACIÓN EN MEMBRANA POR EL SISTEMA DE