Resultados Universidad de Alcalá
A.3. EFECTOS DE LA VITAMINA A SOBRE EL SISTEMA SOMATOSTATINÉRGICO
A.3.1. Expresión del gen de la somatostatina
Una vez comprobados los signos clínicos provocados por la deficiencia de VA, decidimos averiguar si dicha deficiencia podría alterar la vía de señalización de la SST. Para ello, se analizó, en primer lugar, la expresión de la SST en el hipocampo de la rata en condiciones de deficiencia de VA o tras el tratamiento con TTR.
La alimentación de las ratas con un pienso sin VA durante 12 semanas indujo una disminución muy significativa en los niveles hipocampales de SST inmunorreactiva (SST-IR) en comparación con el grupo control (Tabla 18). La deficiencia de VA, sin embargo, no modificó los niveles de ARNm de la SST, como muestra la Figura 42. Tras una semana de tratamiento de estas ratas con TTR, los niveles de SST-IR revirtieron a los valores control mientras que este tratamiento no provocó cambios significativos en dichos parámetros en las ratas control.
Grupos SST-IR (ng/mg proteína)
Control 10,8 ± 1,1
+TTR 9,8 ± 0,6
-VA 1,9 ± 0,5**
-VA+TTR 8,5 ± 2,1
Tabla 18: Concentración de somatostatina inmunorreactiva (SST-IR), determinada mediante radioinmunoanálisis (RIA), en el hipocampo de ratas procedentes de los cuatro grupos experimentales. Control: ratas alimentadas con un pienso estándar durante 12 semanas y tratadas con vehículo durante 1 semana; +TTR: ratas control tratadas con TTR (150 μg/kg/día) durante 1 semana; -VA: ratas alimentadas durante 12 semanas con un pienso sin vitamina A; -VA+TTR: ratas alimentadas durante 12 semanas con un pienso sin VA y tratadas posteriormente durante una semana con TTR (150 μg/kg/día). Los datos se presentan como la media ± E.S.M. de cinco experimentos independientes realizados por duplicado. Comparación estadística frente al control: ** p<0,01.
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A.3.2. Expresión de la prohormona convertasa 2
El siguiente objetivo fue analizar a qué se podía atribuir la falta de correlación entre los niveles de SST-IR y los niveles del ARNm de la SST en el grupo de ratas alimentadas con un pienso sin VA. Dado que la SST se sintetiza como una prepro-hormona inmadura (prepro-SST) que, posteriormente, es escindida por la enzima PC2 para dar lugar al péptido maduro (Patel y Galanopoulou, 1995; Winsky-Sommerer y col., 2003), se estudiaron los niveles de dicha enzima en el hipocampo de estas ratas mediante inmunoblot. Como se observa en la Figura 43, la deficiencia de VA indujo una disminución significativa de los niveles proteicos de PC2 en el hipocampo de las ratas, lo que podría conducir a un menor procesamiento del precursor de la SST. Este efecto revirtió al valor control tras una semana de tratamiento con TTR. No se observaron cambios significativos en el grupo control tratado con TTR
Figura 42. Panel izquierdo: Detección del ARNm de la somatostatina (SST) mediante RT-PCR (A) y Southern-blot (B) en el hipocampo de ratas procedentes de los cuatro grupos experimentales. C: ratas control; +TTR: ratas tratadas con TTR; -VA: ratas alimentadas con un pienso sin VA; -VA+TTR: ratas alimentadas con un pienso sin VA y tratadas posteriormente con TTR. El ARN total aislado y purificado fue sometido a una reacción de retrotranscripción y, a continuación, a 30 ciclos de amplificación con cebadores específicos para la SST y la β-actina (β-act). El producto de la reacción se corrió en un gel de agarosa, se tiñó con bromuro de etidio y, posteriormente, fue hibridado con una sonda específica para la SST marcada con 32P y autorradiografiada a -70ºC. Como
control de contaminación, se realizó un control negativo (-RT) que no contenía muestra. Panel derecho: Análisis densitométrico de las bandas específicas de la SST obtenidas por Southern-blot. Los valores se normalizaron con respecto a la intensidad de la banda de la β-actina y se representan como un porcentaje del valor del grupo control, a cuya densidad óptica se le dio un valor de 100%. Los valores se presentan como la media ± E.S.M. de cinco experimentos diferentes.
500 pb SST β-act SST C +TTR -VA -VA -RT +TTR β-act A B 500 pb SST β-act SST C +TTR -VA -VA -RT +TTR β-act 500 pb SST β-act SST C +TTR -VA -VA -RT +TTR β-act A B 100 75 50 25 0 A D N c S S T / β -a ct (% C on tr ol ) C +TTR -VA -VA +TTR
Resultados
Universidad de AlcaláFigura 43. Panel Superior: Autorradiografía derivada de la inmunodetección de la
prohormona convertasa 2 (PC2) en el hipocampo de ratas procedentes de los cuatro grupos
experimentales. El carril 1 corresponde a ratas control (n=5), el carril 2 a ratas tratadas durante una semana con TTR (n=5), el carril 3 a ratas alimentadas con un pienso sin VA (n=5) y el carril 4 a ratas alimentadas con un pienso sin VA y tratadas posteriormente con TTR (n=5). Las autorradiografías mostradas son una muestra representativa de cinco ensayos realizados. Como control de carga, se empleó β-tubulina (β-tub). Las autorradiografías mostradas son representativas de cinco ensayos realizados. Panel Inferior: Análisis densitométrico de los niveles de PC2 en el hipocampo de ratas control (C), ratas tratadas con TTR (+TTR), ratas deficitarias en VA (-VA) y ratas
deficitarias en VA tratadas con TTR (-VA+TTR). Las densidades ópticas se normalizaron con las
correspondientes a la β-tub y se presentan como porcentajes del control, a cuya densidad, una vez normalizada, se le asignó un valor arbitrario de 100%. Los datos representan la media ± E.S.M. de cinco experimentos independientes. Comparación estadística frente al control: * p<0,05.
A.3.3. Receptores de somatostatina
A.3.3.1. Parámetros de unión de la somatostatina a sus receptores
A la vista de los resultados anteriores, se procedió, a continuación, a analizar los parámetros de unión de la SST a sus receptores específicos de membrana, que median las acciones del péptido. El análisis de dicha unión se realiza en membranas mediante estudios de competición, donde la 125I-Tyr11-SST-14 se desplaza con concentraciones crecientes de SST fría. Estudios preliminares con membranas procedentes del hipocampo revelaron que estos receptores unen la 125I-Tyr11-SST-14 de forma dependiente del tiempo, alcanzándose un equilibrio aparente a los 60 minutos, a 30ºC, que permanece estable durante al menos 120 minutos. Por ello, los ensayos de unión competitiva se realizaron bajo estas condiciones
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