Las dosis de CFQ en las diferentes fuentes bibliográficas son variables, según la especie empleada, vía de administración y objetivos planteados. Las dosis en dichos trabajos, en general, son de 1 o 2 mg/kg tanto por la vía IV como la IM en cerdos (Block et al, 2005; Li
et al, 2008), cabras (Errecalde et al, 2001), ovejas (Tohamy, 2011), terneros (Errecalde et al, 2002), caballos (Winther et al, 2011), camellos (Al-Taher, 2010) y pollos (El-Gendy et al, 2009), e inclusive Limbert et al (1991) emplearon 5, 10 y 20 mg/kg en perros, cerdos o
vacas por las vías IV, IM o SC. Es de destacar que pese a la variación de dosis, en ninguno de los trabajos citados se informaron efectos adversos.
En nuestro caso hemos utilizado una dosis de 2 mg/kg para las vías IV e IM, las cuales son suficientes para asegurar las concentraciones plasmáticas durante un período de tiempo adecuado (de al menos tres semividas) fundamentalmente para poder definir los procesos de eliminación, tal como lo recomiendan las normativas de regulación de medicamentos en la Unión Europea (EudraLex Volume 8, 2005).
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La vía de administración IV si bien no es la que normalmente se utiliza a campo para el tratamiento de infecciones, es la indicada para definir el comportamiento cinético de los fármacos y poder establecer la biodisponibilidad absoluta a partir de otras vías.
La administración IM se escogió porque el preparado comercial está diseñado para tal fin y es una de las vías recomendadas para CFQ. Se inyectó entre los músculos semitendinoso y semimembranoso en único punto, ya que en ningún momento se superó el volumen total de 5 ml.
El producto IMM está formulado para la especie bovina y la dosis que recomienda el laboratorio es de 75 mg por cuarto mamario. No existen dosis de referencia para la especie caprina. La dosis adoptada en este caso (10 mg por medio mamario), surgió por extrapolación, teniendo en cuenta que una vaca promedio produce entre 5 a 7 litros por cuarto mamario y la cabra tan sólo 0,5 a 1 litros por medio.
V.2.2.- Metodología analítica
Existen diversas técnicas analíticas para detectar y cuantificar un betalactámico en suero, leche u otras matrices, siendo las más frecuentes para estudios farmacocinéticos la cromatografía líquida de alta eficacia (high performance liquid chromatography o HPLC) y la microbiológica de difusión en agar, existiendo en general una buena correlación entre los resultados de ambas metodologías (Arcellonia et al, 1996; Da Silveira y Schapoval, 2002; Guerra et al, 2005; Mendez et al, 2005; Souza et al, 2006; Bergold, 2007; Schmidt
et al, 2009). Sin embargo con la técnica microbiológica sólo se logra caracterizar la
actividad antimicrobiana y no el compuesto per se, especialmente si tiene metabolitos activos; sobreestimando ocasionalmente el valor de algunos parámetros farmacocinéticos (Cester et al, 1996; McKellar et al, 1999).
Las técnicas en las que nos hemos basado para la detección y cuantificación de CFQ con equipo HPLC, están descriptas por Sørensen y Snor (2000), Suhren y Knappstein (2003) y Li et al (2008) quienes trabajaron con leche y/o suero, e incluso por la descripta por Zhang
et al (2007) quienes trabajaron con músculo, grasa, hígado y riñón porcino. Estas mismas
técnicas además han sido utilizadas por Winther et al (2011), Cagnardi et al (2010) y Zonca et al (2011).
Todas ellas, al igual que la elegida por nosotros, utilizan un HPLC acoplado a un detector con luz ultravioleta (UV), debido a que las cefalosporinas son compuestos con alta absorbancia en el espectro UV (Gallo Martínez et al, 2002). Cabe aclarar que existen técnicas donde la detección de CFQ es realizada mediante espectrometría de masas
(Maes et al, 2007) la cual disminuye sensiblemente el límite de cuantificación. Sin embargo, esta técnica no está tan difundida como el HPLC con detector UV debido a su costo, y porque la sensibilidad de este último método es adecuado para la realización de estudios farmacocinéticos.
Tanto el equipo, las columnas y las condiciones cromatográficas que empleamos son similares a los trabajos citados previamente. Mientras que nosotros hemos utilizado una longitud de onda para la detección UV de 267 nm, una temperatura de la columna de 36 °C , flujo de 2 ml/min y un volumen de inyección de la muestra de 20 µl, el resto de los trabajos emplearon una longitud de onda entre 265 a 270 nm, la columna a 20, 24, 30 o 45 °C según el caso, un flujo de 0,5 a 1 ml/min y volumen de inyección entre 20 y 100 µl. Nuestro tiempo medio de retención de 7 minutos fue similar al descripto por Zhang et al (2007); Li et al (2008); Winther et al (2011) y Zonca et al (2011) y diferente a los 15 minutos de Suhren y Knappstein (2003) y 30 minutos de Sørensen y Snor (2000).
Las técnicas extractivas empleadas son diferentes en todos los casos, dependiendo si la matriz es leche, suero o incluso músculo, grasa, hígado y riñón en el caso de Zhang et al (2007). Las fases móviles son en general combinaciones en distintas proporciones de agua y acetonitrilo (a veces metanol) con soluciones amortiguadoras tales como fosfato de tetraetilamonio (0,1 M; pH 5), ácido octanosulfónico (0,005 M; pH 2,52) o ácido fosfórico (0,085 M; pH 2,8).
A diferencia de las extracciones empleadas en dichos trabajos, no empleamos cartuchos de extracción en fase sólida ni tampoco hemos desecado y reconstituido el extracto, previo a su inyección en el HPLC.
Presentamos límites de detección y cuantificación (0,018 y 0,037 µg/ml, respectivamente) superiores a los descriptos por estos trabajos (con límites de detección entre 0,001 y 0,010 µg/ml, y de cuantificación generalmente de 0,010 µg/ml), aunque suficientes para los objetivos que nos hemos planteado en esta tesis. Sin embargo, la validación que hemos realizado presenta similares características de en cuanto a la linealidad, precisión, exactitud y recuperación, y acorde a lo exigido por las normativas de validación GL 2, del programa VICH (1998b) mencionados en materiales y métodos, así como también, con los incluidos recientemente en los Procedimientos de validación para métodos bioanalíticos, EMEA/CHMP/EWP/192217/2009, de la Agencia Europea del Medicamento (2009).
Por último, las concentraciones de CFQ cuantificadas en líquido amniótico y cotiledón placentario, fueron determinadas por extrapolación directa desde la curva de calibrado realizada en suero. Si bien, lo ideal es realizar esta curva para cada matriz en particular (McDowall, 2005), es de destacar que al no ser frecuente la realización de operaciones
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cesáreas en caprinos, considerábamos innecesario el someter a un animal a ese procedimiento, cuando los resultados del estudio no justifican el empleo de mas individuos (uso mínimo de animales según los principios de bienestar animal). Además, la composición del líquido amniótico, si bien va variando conforme el feto se desarrolla, se puede considerar parecida a la de suero sanguíneo (Brace, 1995; Gómez Ruiz y Montalvo Montes, 2006) y por lo tanto podemos realizar el cálculo de las concentraciones en esta matriz por extrapolación directa, tal como lo realizaron Lima et al (2005).