Electroinmunotransferencia de proteínas o “western blotting” 88

los sistemas de electrotransferencia (Biorad) y los pasos son los siguientes: 

Electroforesis  desnaturalizante  de  extractos  proteicos  en  geles  de 

poliacrilamida al 10 % con SDS (Sodium Dodecil Sulfato). En el caso de extractos 

provenientes de cultivos celulares se cargaron 10 µl del extracto, y para extractos 

provenientes de embriones se cargaron 40 µg de proteína total. Previamente los 

extractos fueron desnaturalizados en tampón de carga SDS 2X (50 mM Tris‐HCl 

durante 7‐10 min a 100oC (agua en embullición). Las muestras se separaron 

mediante electroforesis a un amperaje constante de 10‐12 mA en el tampón de 

electroforesis (25 mM Tris base, 250 mM glicina pH 8.3, 0,1 %(p/v) SDS). En el 

caso de EIT con pocos embriones, se cargaron en el gel  ≈15‐20 embriones 

tempranos recogidos según el protocolo de Su, (2000). 

Inmovilización  de  las  proteínas  en  membranas  de  PVDF  (del  inglés 

Polyvinylidene  Difluoride    Western  Blotting  Membrana)  mediante 

electrotransferencia en tampón 8 mM Tris base, 39 mM glicina y 0,0375 % SDS. 

Para la inmunodetección, la membrana se equilibró con PBST (PBS 1X y 0,05 % 

Tween 20) y se bloqueó con 3 % BSA en PBST a TA durante 1 h o a 4oC TN. Luego 

se llevaron a cabo los siguientes pasos: 

o Incubar la membrana con el anticuerpo primario a TA durante 1‐2 h o a 4oC 

TN y en agitación suave. 

o Hacer 3 lavados con tampón PBST, de 4 min cada uno. 

o Incubar la membrana con los anticuerpos secundarios conjugados con la 

enzima peroxidasa. Incubar a TA durante 30‐45 min y en agitación suave. 

o Hacer tres lavados con PBST de 4 min cada uno. 

o Añadir a la membrana el sustrato quimioluminiscente, Pierce ECL Western 

Blotting  Substrate,  o  en  el  caso  de  la  inmunotransferencia  con  pocos 

embriones, añadir el reactivo Supersignal®West Pico, de mayor sensibilidad 

que el anterior (Tabla MM5).  En ambos casos se siguieron las instrucciones 

del fabricante.      

o Exponer en un cassette de revelado la membrana a una película.   

En el caso de la EIT competida, se realizó todo exactamente igual a lo 

comentado,  exceptuando  que  el  anticuerpo  primario  era  previamente 

preincubado con la proteína GST‐Cbt∆Zn (0,5 µg/µl) o la proteína Cbt traducida 

in vitro (50 µl) durante 4 h a TA o TN a 4oC   1.8. EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS 

1.8.1 Expresión y purificación de la proteína GST‐Cbt∆Zn 

Para la expresión de la proteína de fusión GST‐Cbt∆zn, y de la proteína GST 

se utilizó la cepa BL21 de E. coli con baja actividad proteasa para reducir la 

degradación de proteínas. La expresión y la purificación se realizaron siguiendo 

las instrucciones descritas en el manual GST Gene fusion system (Pharmacia 

Biotech), aunque modificando el tiempo de inducción con 0,1 mM de IPTG a 3 h 

para reducir la degradación de la proteína GST‐Cbt∆Zn y añadiendo al medio 

Posteriormente se llevó a cabo la extracción de las proteínas a partir de los 

cultivos mediante el procesamiento mecánico, utilizando altas presiones en el 

vacío generadas por una prensa francesa o “French Press”.  

La purificación de  las  proteínas GST y GSTCbt∆zn se  realizó mediante 

cromatografía de afinidad utilizando Glutation sefarosa 4B (GE Helathcare), una 

matriz de sefarosa capaz de reconocer y unir la GST. En esta matriz la molécula 

de  glutatión  queda  anclada  a  la  sefarosa  dejando  libre  un  sitio  de  unión  

complementario a la unión de la glutatión S‐transferasa. Para la purificación se 

utilizó el procedimiento de “batch”. 

Los niveles de expresión y de purificación de las proteínas se visualizaron 

mediante electroforesis y tinción de Comassie. La cuantificación de las proteínas 

se  realizó  mediante  espectrofotometría.  Además  se  realizó  una  EIT  con 

anticuerpo anti‐GST, para comprobar que las bandas observadas en los geles 

correspondían a la proteína de fusión GST‐Cbt o/y subproductos de degradación 

(Fig. MM3) 

Figura MM3. Purificación de la proteína GST‐CBT∆Zn. (A) Elución de la columna de purificación por afinidad  de la proteína GST‐Cbt∆Zn. Se puede observar una banda mayoritaria de  ≈66 kDa que corresponde a la  proteína GST‐Cbt∆Zn y otras bandas de menor tamaño debidas a la degradación/procesamiento de la  proteína de fusión. (B) EIT con el anticuerpo anti‐GST‐POD que muestran que el extracto eluído corresponde  a la proteína GST‐Cbt∆Zn y fragmentos de degradación de la misma. 

1.8.2. Expresión in vitro de la proteína CbtFL. 

Debido a que la proteína Cbt completa es tóxica en bacterias y con el 

objeto de obtener esta proteína para los ensayos funcionales de retardo en gel, 

la proteína Cbt fue expresada in vitro utilizando el kit comercial TnT®Quick 

Coupled  Transcription/Translation  Systems  (Tabla  MM5),  siguiendo  las 

recomendaciones de su manual y añadiendo ZnSO4. Para ello, clonamos la ORF 

clonación múltiple y además la región 5`UTR de la  β‐globina, incrementándose 

así el rendimiento de la transcripción del gen clonado en el vector. 

Para comprobar que la proteína se traducía correctamente llevó a cabo la 

reacción en presencia de MetS35 tanto en la muestra con el vector pT7‐Flag‐Cbt 

como en la muestra control con el vector pT7 vacío y el plásmido pLuc. 5 µl de 

cada mezcla de reacción se analizaron en un gel desnaturalizante PAGE 10 %, que 

posteriormente se transfirió a papel Whatman utilizando un desecador y se 

sometió a autorradiografía durante 3 h en una pantalla de BaFBrEu que fue 

revelada en un detector de imágenes fotoestimulable. En etapas posteriores, la 

comprobación de que la proteína era traducida se realizó mediante EIT utilizando 

el anticuerpo anti‐Cbt∆Zn (Fig. MM4).                   

Figura MM4. Detección de la transcripción/traducción in vitro de la proteína Flag‐Cbt. A la izquierda,  autorradiografía obtenida tras la transcripción/traducción in vitro de la proteína Flag‐Cbt en presencia  de MetS35. A la derecha, EIT de la transcripción/traducción in vitro, utilizando anticuerpo anti‐Cbt∆Zn.  pLuc y el extracto TnT son controles.