5.1. CULTIVO Y MANTENIMIENTO DE CÉLULAS S2 DE D. melanogaster, Sec301
DE Spodoptera exigua Y CHO‐K1, DE Cricetulus griseus
La línea celular S2 deriva de un cultivo primario de células de embriones
tardíos (20‐24 h) de D. melanogaster y las células Sec301 provienen de ovarios
de larvas de Spodoptera exigua. Las células S2 y Sec301 crecen a 28oC en
ausencia de CO2, formando una monocapa semi‐adherente en medio
“Schneider’s Drosophila Medium“ (MD) o en Medio Grace´s respectivamente,
suplementado con 10 % de suero fetal bovino inactivado por calor y con
antibióticos, 5 ml/l de penicilina‐streptomicina. Para su mantenimiento, las
células son transferidas a un medio nuevo cuando la densidad celular alcanza la
cifra de 6‐20 x 106 células vivas/ml. Las células CHO‐K1 derivan de un cultivo
primario de células ováricas de hámster chino adulto y crecen a 37oC con un 5 %
de CO2, formando una monocapa adherente que debe ser tripsinizada para
separar las células del sustrato.
5.2. TRANSFECCIÓN TRANSITORIA DE CÉLULAS
El método utilizado para transformar células S2, Sec301 y CHO‐K1 ha sido
el basado en la lipofección (Felgner et al., 1987). Este método se basa en la
formación de complejos entre lípidos catiónicos y ADN. El complejo tiene
afinidad por la membrana y permite la entrada del ADN en el citosol. Una de las
posibles vías es la incorporación de liposomas a la membrana y la entrada flip‐
flap. Existen un gran número de lípidos que se emplean en lipofección, aunque
existe una estructura consenso de un lípido catiónico sintético, a partir del cual
se han diseñado muchas variantes. Es esencial optimizar las condiciones de
transfección para obtener buena eficiencia. Además como no todos los lípidos
funcionan en todos los tipos celulares, hay que optimizar el ensayo para cada
tipo celular. Los parámetros a optimizar son la relación entre lípido y ADN
(relación de cargas), la cantidad de ADN empleado, el tiempo que se exponen las
El protocolo empieza tres días antes de la transfección y se explica a
continuación. Las transfecciones se realizaron en placas de 24 pocillos.
Primer día:
Crecer células frescas, realizando una dilución 1:1 en MD con antibióticos. Soltar las células de la pared de la botella en la que han crecido, con pequeños golpes en la misma o utilizando tripsina en el caso delas células CHO‐K1. Dejar crecer 24 h.
Segundo día:
Cambiar el MD y determinar la densidad celular mediante una cámara de recuento de células. Para ello se realizan diluciones seriadas y se cuenta en una cámara de Weber. Es necesaria una densidad de 4.5 x 105 células/pocillo en las placas de 24 pocillos.
Determinar el volumen de cultivo que se necesita (nO de pocillos a transfectar x 4.5 x 105 células/pocillo) y añadir MD sin antibióticos (es recomendable dejar 24 h a las células sin antibióticos para que no estén débiles en el momento de la transfección) hasta un volumen total de 500 μl/pocillo.
Introducir en cada pocillo un cubreobjetos de 12 mm de diámetro al que se adherirán las células.
Añadir 500 μl de medio con células y dejar en el incubador 24 h.
Tercer día:
Preparar las mezclas de ADN y de lipofectina.
Calcular el volumen necesario para el número de pocillos a transfectar con esa construcción y utilizando 1 μg/pocillo de ADN.
Añadir un volumen final de 60 μl/pocillo de medio DM sin suero fetal bovino.
Calcular el volumen necesario para el número de pocillos, a los que se les añade 42 μl de medio DM sin suero más 8 μl de Lipofectina. En este caso se utiliza el lípido Cellfectina (específico para transfectar células de insecto y de mamífero). Agitar la Cellfectina antes de usar.
Mezclar los dos medios pipeteando suavemente y sin agitar. Incubar la mezcla a TA de 15‐30 min.
5 min antes de acabar la incubación, se retira el medio de las células y se hace un lavado con DM sin suero.
Añadir 480 μl de MD sin suero a cada pocillo.
Pipetear 120 μl de la mezcla agitando previamente por succión de la pipeta. Verter la mezcla gota a gota y de forma homogénea en el pocillo.
Incubar en la estufa durante 5‐6 h y retirar el medio ya que el lípido es tóxico para las células.
Realizar un lavado con MD con suero y sin antibióticos.
Dejar en MD con suero y sin antibióticos.
Cuarto día:
Análisis en el microscopio invertido de fluorescencia (en el caso de que se utilice la GFP como proteína reportera) o realizar tinciones inmunohistoquímicas según el apartado MM5.3.En algunos casos se dejó hasta 7 días incubándose en medio DM con antibióticos para determinar el tiempo óptimo de traducción de la proteína.
La transfección de células CHO‐K1 es igual a la comentada exceptuando
que en el día 2 de la transfección se mezclan 100 µl de medio sin suero con 9 µl
de FUGENE HD y se deja reposar 5 min. Posteriormente, se añade 1 µg de ADN y
se dejan reposar otros 15 min para posteriormente verter gota a gota el
complejo en 400 µl de medio sin suero. La transfección se deja TN y no hace falta
cambiar el medio.
5.3. FIJACIÓN DE CÉLULAS, INMUNOHISTOQUÍMICA Y PREPARACIÓN PARA SU
OBSERVACIÓN EN EL MICROSCOPIO CONFOCAL
Eliminar el MD y lavar una vez con PBS 1 X.
Bloquear las células durante 15 min en PBS‐1 % BSA.
Lavar 2X con PBS.
Fijar con PFA al 4 % a TA durante 20 min.
Lavar 3X con PBS 1X.
Permeabilizar las células durante 10 min con 0,2 % Tritón‐X‐100.
Lavar 3X con PBS 1X.
Bloquear las células durante 30/60 min en PBS‐1 % BSA.
Incubar durante 2 h con 200 µL de la dilución correspondiente del/los anticuerpo(s) primario(s).
Lavar 3X con PBS‐1 % BSA.
Incubar durante 1 h con 200 µL de la dilución correspondiente del/los anticuerpo(s) secundario(s).
Lavar 3X con PBS 1X.
Postfijar durante 30 min con PFA al 2 %.
Lavar 3X con PBS 1X.
Montar en portar con una gota de medio de montaje al que se le ha añadido el colorante de ácidos nucleicos DAPI [“Vectashield mountaing medium for fluorescente with DAPI” (1,5 μg/ml)].
Sellar para evitar la entrada de aire y se guarda a ‐20oC en oscuridad.
Análisis de las muestras en microscopio confocal TCS SP2.