Eliminación del disolvente orgánico y estabilización de la muestra

Una vez elegidas las condiciones experimentales para la etapa de digestión con CuBr2,

el siguiente paso fue optimizar la segunda etapa, consistente en la extracción del MeHg liberado de la matriz sólida mediante un disolvente orgánico. El disolvente a emplear es el CH2Cl2, por su idoneidad para extraer selectivamente compuestos orgánicos de

mercurio [38, 39]. El volumen de CH2Cl2 elegido fue de 10 ml, al igual que el empleado

en el método de Bloom et al. [38] y que se considera apropiado para el peso de muestra de 0,5 g.

En esta etapa el principal problema a resolver fue la conveniencia de realizarla conjuntamente con la etapa anterior o bien realizarla de forma independiente. El propósito, en base a la rapidez y operatividad del método, fue tratar de conseguir realizarla simultáneamente a la digestión (primera etapa). Para dilucidar esto, se aplicaron las condiciones elegidas para la digestión a la realización simultánea de digestión y extracción añadiendo 10 ml de CH2Cl2 a cada tubo de centrífuga

conteniendo la muestra sintética y la disolución de CuBr2. Los resultados se

Capítulo 5: DESARROLLO DE UN MÉTODO DE EXTRACCIÓN DE Hg ORGÁNICO

sucesivamente. Las condiciones de estos ensayos así como las recuperaciones obtenidas se muestran en la figura 5.5.

5 mL CuBr₂0,3 M Tie mpo: 120 minutos

Centrifugación y e xtracc ión de 4 mL de sobrenadante

10 mL CH₂Cl₂Tie mpo: 60 minutos

Centrifugación y e xtracc ión de fase orgánica

Extracción independiente Extracción simultánea

Recuperación = 97,5% ± 4,8% Tie mpo Total =210 minutos

5 mL CuBr₂0,3 M + 10 mL CH₂Cl₂Tie mpo: 120 minutos

Centrifugación y e xtracc ión de fase orgánica

Recuperación = 94,5% ± 5,3% Tie mpo Total =135 minutos

0,5 g de muestra +

0,5 g de muestra +

5 mL CuBr₂0,3 M Tie mpo: 120 minutos

Centrifugación y e xtracc ión de 4 mL de sobrenadante

10 mL CH₂Cl₂Tie mpo: 60 minutos

Centrifugación y e xtracc ión de fase orgánica

Extracción independiente Extracción simultánea

Recuperación = 97,5% ± 4,8% Tie mpo Total =210 minutos

5 mL CuBr₂0,3 M + 10 mL CH₂Cl₂Tie mpo: 120 minutos

Centrifugación y e xtracc ión de fase orgánica

Recuperación = 94,5% ± 5,3% Tie mpo Total =135 minutos

0,5 g de muestra +

0,5 g de muestra +

Figura 5.5. Comparación de los procedimientos de extracciones independientes y simultáneas.

Como puede verse, las recuperaciones obtenidas son igualmente aceptables en ambos casos. Sin embargo, en el primero el tiempo necesario para extraer el MeHg es considerablemente superior al que se requiere si realizamos la extracción de forma simultánea. Por ello y una vez demostrada su viabilidad, se optó por realizar las dos etapas de forma conjunta en las condiciones dadas en la figura 5.5.

Una vez extraído el MeHg de forma selectiva, es necesario eliminar el disolvente orgánico, que queda en la parte inferior del tubo de centrífuga, para poder determinar el mercurio orgánico en el equipo DMA-80. Para lograr esto, en el desarrollo del método se ensayó un abanico de posibilidades que podríamos resumir en los siguientes puntos:

1. Toma de 8 mL de fase orgánica y evaporación de la misma en vasos de precipitados calentando en placa calefactora a unos 60 ºC durante 30 minutos. Adición posterior de 1 mL de HNO3 al 50% v/v y se aforó a 5 mL con agua ultrapura.

2. Toma de 8 mL de fase orgánica con pipeta y evaporación de la misma en vasos de precipitados a los cuales se añadieron 2 mL de disolución de NAC al 0,5% p/v, calentando en placa calefactora a unos 60 ºC durante 30 minutos. Aforado a 5 mL con agua ultrapura.

3. Toma de 8 mL de fase orgánica y evaporación de la misma en vasos de precipitados con 2 mL de disolución de NAC al 0,5% p/v, en los cuales se hacía burbujear N2

durante 1 hora.

4. Toma de 200 μL de fase orgánica con jeringas de HPLC y evaporación de la misma en cubetas de cuarzo del equipo DMA-80 en campana de gases a temperatura ambiente.

5. Toma de 200 μL de fase orgánica con jeringas de HPLC y evaporación en cubetas de cuarzo con 50 μL de disolución de NAC al 0,5% p/v, en campana de gases a temperatura ambiente.

6. Toma de 200 μL de fase orgánica con jeringas de HPLC y evaporación en cubetas de cuarzo a las cuales se añadieron previamente 100 μL de disolución de NAC al 1% p/v, en campana de gases a temperatura ambiente. Una vez finalizado el período de evaporación se añadieron a cada cubeta 200 μL de HNO3 al 5% v/v.

Las recuperaciones obtenidas en cada uno de los procedimientos ensayados se muestran en la tabla 5.3.

Tabla 5.3. Recuperación de mercurio en los diferentes procedimientos de evaporación ensayados.Los resultados representan el valor medio ± tres veces la desviación estándar (n = 4).

Procedimiento 1 2 3 4 5 6

Recuperación (%) 56,9 ± 14,7 87,6 ±0,4 111,6 ± 9,7 4,0 ± 1,8 60,9 ± 13,4 95.8 ± 3.3

En las primeras condiciones ensayadas (procedimiento 1) se observó que al añadir el HNO3 para redisolver el MeHg, se producía la formación de precipitados blancos a

modo de estrías que no pudieron ser completamente disueltos al añadir el agua y aforar. La recuperación obtenida por este procedimiento fue muy baja y además la reproducibilidad tampoco fue satisfactoria con lo cual hubo que descartarlo. Las

Capítulo 5: DESARROLLO DE UN MÉTODO DE EXTRACCIÓN DE Hg ORGÁNICO

recuperaciones fueron mayores al tratar de ensayar la evaporación mediante el paso de una corriente de N2 a través de las muestras. La adición de NAC parece favorecer la

retención de las especies orgánicas de mercurio en la fase acuosa. En este procedimiento también se observó la formación durante la evaporación de precipitados blancos muy voluminosos que iban desapareciendo al eliminarse el disolvente. En el procedimiento 3, que combina una evaporación convencional en placa con el uso de NAC como agente reextractante se obtuvieron recuperaciones muy altas, al tiempo que la reproducibilidad obtenida fue superior al 5% (RSD). Éste procedimiento se consideró en principio satisfactorio y se trató de ensayar con sedimentos, encontrándose que al centrifugar y tratar de recoger la fase orgánica con pipetas convencionales, la fase sólida se removía y no podía realizarse una extracción limpia del sobrenadante orgánico. Para superar estas dificultades se propuso un procedimiento alternativo, en el cual se emplearon jeringas de HPLC (figuras 5.6 y 5.7) para recoger alícuotas de la fase orgánica. Mediante el empleo de estas jeringas se evita que la fase sólida se remueva, pudiendo tomar un volumen exacto de fase orgánica en cada alícuota y, además, se permite que la evaporación pueda realizarse en las propias cubetas de medida del equipo DMA-80, lo cual supone una ventaja en términos de tiempo y simplicidad del método. Se eligió un volumen estándar para las alícuotas de la fase orgánica de 200 μL, adecuado para el volumen máximo de las cubetas de cuarzo del equipo DMA-80. Dada la volatilidad de la fase orgánica y el bajo volumen a evaporar se pudo realizar la evaporación a temperatura ambiente, lo que evitó la formación de precipitados como ocurría en los 3 procedimientos anteriores. En el procedimiento 4 se realizó la evaporación sin adición de ningún agente reextractante, procediéndose a la medida directa en las cubetas, obteniéndose unas recuperaciones extremadamente bajas, lo que implica, que el MeHg en ausencia de algún agente o fase acuosa se evapora junto al CH2Cl2. La adición previa

de disolución NAC a las cubetas mejoró sustancialmente la recuperación del MeHg (procedimiento 5). Sin embargo, al analizar réplicas de la misma muestra, se observaba una disminución gradual de la absorbancia en cada una de las medidas (figura 5.8), lo cual quiere decir que las disoluciones no son estables en el interior de las cubetas y se va perdiendo MeHg durante el procesado de las muestras en el equipo, probablemente como consecuencia de las altas temperaturas generadas en el mismo. Este problema finalmente se solventó mediante la adición a cada cubeta de 200 μL de HNO3 al 5% v/v

6). La adición de este reactivo permitió la obtención de recuperaciones cuantitativas del MeHg extraído, a la vez que mejoró de forma sobresaliente la reproducibilidad de las medidas (figura 5.9).

Figura 5.6. Jeringas de HPLC usadas para la toma de alícuotas de la fase orgánica

Figura 5.7. Deposición de una alícuota de fase orgánica en una cubeta de cuarzo

0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,025 1 2 3 4 Réplica A b so rb an ci a

Figura 5.8. Descenso de la absorbancia durante el análisis en muestras sin adición de ningún agente estabilizante

Capítulo 5: DESARROLLO DE UN MÉTODO DE EXTRACCIÓN DE Hg ORGÁNICO 0,01 0,02 0,03 1 2 3 4 Réplica A b so rb an ci a

Figura 5.9. Efecto de la adición de HNO3 al 5% v/v sobre la absorbancia

Estas últimas condiciones, expuestas en el procedimiento 6, fueron las seleccionadas finalmente para la etapa de evaporación. El tiempo inicial 30 minutos se evaluó y contrastó con otros inferiores para tratar de optimizar en lo posible esta etapa. Los resultados de esta optimización se muestran en la figura 5.10. A partir de 20 minutos la recuperación de MeHg es superior al 95%. Finalmente se estableció un tiempo de evaporación de 25 minutos. 80 85 90 95 100 10 20 25 30 Tiempo (min) R ecu p er aci ó n d e M eH g ( % )