Empleo de polímeros microbianos para la formación de perlas.

4.1.1.1 Selección de las mezclas de polímeros para la

inmovilización microbiana mediante el método de goteo.

Los polímeros microbianos gelano, xantano, pululano y jamilano se probaron individualmente para la producción de perlas mediante el método de goteo en un rango de concentraciones del 0,5% al 2%. De todos estos polímeros, solamente el gelano fue capaz de producir perlas con forma (esférica o esfera imperfecta) y consistencia adecuada, al contrario que los polímeros microbianos restantes, que no mostraron una gelificación adecuada en forma de perlas aplicando esta metodologia.

A pesar de ser el gelano un polímero apto para la obtención de perlas, se emplearon concentraciones elevadas, mayores de un 1%, para obtenerlas. El gelano gelifica principalmente por la acción de cationes (p.ej. iones Ca2+ de la solución de CaCl2) pero a temperaturas bajas se encuentra en forma de gel

sólido. Esta gelificación con la temperatura va a estar directamente asociada a la concentración de gelano que se emplea, de tal manera que a las concentraciones a las que es capaz de formar perlas, se necesitará una temperatura elevada (mayor de 60ºC) para que no gelifique (Camelin, et al., 1993) y que en estas condiciones se pueda añadir el concentrado probiótico antes de la formación de las perlas.

Para evitar estos inconvenientes, que pueden afectar a la supervivencia microbiana durante el proceso, se realizaron mezclas de gelano con los otros polímeros (xantano, pululano y jamilano) con el propósito de intentar disminuir la temperatura de gelificación y facilitar la manipulación de los polímeros durante la inmovilización. Así, un rango de concentraciones de gelano (0,5%- 2%) se combinó con un rango de concentraciones de los restantes polímeros microbianos (0,2%-1,5%).

Las mezclas de gelano con pululano fueron incapaces de formar perlas, ya que al caer la gota de polímero a la solución de recogida de cloruro cálcico se formaban medias esferas (Figura 27). Por ello se descartóesta mezcla polimérica para la encapsulación de probióticos. No obstante, las mezclas de gelano con xantano y con jamilano demostraron ser capaces de formar perlas mediante la metodología ensayada. De esta manera se seleccionaron las mejores mezclas de polímeros para la formación de perlas e inmovilización microbiana a partir de las últimas mezclas poliméricas, atendiendo a la forma redondeada, la calidad y el menor diámetro de las perlas obtenidas.

Todos los polímeros ensayados solo fueron capaces de formar esferas imperfectas con el método de goteo empleado, de este modo, se seleccionaron las perlas con la forma más esférica. Así, de acuerdo con estos resultados y con el menor diámetro de las perlas, las mezclas que se seleccionaron para la encapsulación microbiana fueron: 1% Gelano con 1% Jamilano y 0,75%

Gelano con 1% Xantano.

4.1.1.2 Obtención de cápsulas aplicando el generador

electrostático de goteo y caracterización de las perlas.

Aunque se eligió inicialmente el método de goteo por ser una metodología menos laboriosa y más práctica que las técnicas de emulsión, en términos generales genera perlas de 2-4 mm de diámetro (Muthukumarasamy,

et al., 2006), lo que hace deseable una reducción de su tamaño, dado que el

objetivo final es incluir los probóticos en alimentos, en los que el tamaño de las Fig. 27 Medias perlas

formadas con las mezclas de pululano y gelano (1x). 

perlas debe ser muy pequeño. Para ello se propuso el empleo de otra metodología de inmovilización por goteo, la del generador electrostático de

goteo. Esta técnica ha demostrado ser eficaz para la producción de perlas de

polímeros con alginato de pequeño tamaño (inferior a 2 mm e incluso de micras) e inocua para varios tipos de células como la levadura de cerveza o células de plantas (Manojlovic, et al., 2006).

Las perlas que se prepararon inicialmente mediante el método de goteo con las mezclas de polímeros seleccionadas, a pesar de ser las de menor tamaño empleando dicha técnica, presentaron un diámetro mayor al deseable para su aplicación en industria alimentaria. Es importante reducir al mínimo el efecto de la adición de las perlas sobre las características sensoriales del producto alimentario (p.ej. yogur) para una mejor aceptación del mismo por parte del consumidor (Adhikari, et al., 2003; Kailasapathy, 2006), por lo que mediante la aplicación del generador electrostático de goteo se pretendió evitar un tamaño excesivo de las mismas que pueda alterar estas características.

Mediante el empleo del método del generador electrostático de goteo se consiguió con éxito una reducción del tamaño de las perlas con ambas mezclas poliméricas (1% Gelano:1% Jamilano y 0,75% Gelano:1% Xantano), sin que afectara en ningún aspecto a la forma de las mismas en comparación con las obtenidas con el método de goteo (Figura 28).

Fig. 28 Morfología y tamaño de las perlas obtenidas con diferentes mezclas poliméricas (amplificación 1x). a) Xantano:Gelano goteo simple, b) Xantano:Gelano generador electrostático de goteo; c) Jamilano:Gelano goteo simple; d) Jamilano:Gelano generador

La observación al microscopio electrónico de barrido (SEM) reveló que ambos tipos de perlas presentaban una superficie homogénea, aunque las perlas de Xantano:Gelano evidenciaron una superficie más lisa que las de Jamilano:Gelano. Además, en ningún caso se detectaron cavidades o fracturas en dicha superficie (Figura 29).

Junto con el análisis de la forma y superficie de las perlas, se realizó un estudio del tamaño y distribución de las perlas obtenidas con ambas mezclas de polímeros, datos que se muestran en la tabla 39. Se observa que las perlas formadas con Xantano:Gelano presentan un diámetro medio inferior a las de Jamilano:Gelano, aunque ambos se encuentran alrededor de los 2 mm de diámetro.

Tabla 39. Distribución del tamaño de las cápsulas obtenidas mediante el método del generador electrostático de goteo (n=170)

Rango de tamaño

(µm) Diámetro equivalente (mm) Diámetro medio (mm)a

Xantano:Gelano 750-3500 1,75 1,71±0,48

Jamilano:Gelano 1250-4000 2,25 2,47±0,54

a _{Resultados expresados como Media±DS (n=170)}

Fig. 29 Images del SEM de perlas obtenidas mediante el generador electrostático de goteo: a) y c) Perlas de Xantano:Gelano (1%:0,75%); b) y d) Perlas de