Endonucleasas de restricción

Las endonucleasas de restricción se encuentran como parte de un mecanismo que utilizan para degradar al ADN extraño (exógeno). Son proteínas que se pegan particularmente a la doble cadena del ADN y la rompen en sitios específicos. El protocolo para el rompimiento con las endonucleasas de restricción, consiste simplemente en incubar el ADN con las enzimas bajo condiciones apropiadas. La cantidad de enzima, ADN y amortiguador (normalmente proporcionado por la casa comercial), así como la temperatura y la duración de la reacción, pueden variar dependiendo de la aplicación específica. Las enzimas de restricción son lábiles y costosas, siempre se deben de manipular en hielo y regresarse al congelador inmediatamente después de su uso (a – 20°C)72

. 2.2.16. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa, cuyas iniciales en inglés son PCR "polymerase chain reaction", es una técnica que fue desarrollada por Kary Mullis a mediados de los años 80. Con esta metodología se pueden producir en el laboratorio múltiples copias de un fragmento de ADN específico, incluso en presencia de millones de otras moléculas de ADN. Como su nombre indica, se basa en la actividad de la enzima ADN polimerasa que es capaz de fabricar una cadena de ADN complementaria a otra ya existente. Sus únicos requerimientos son que existan nucleótidos en el medio que son la materia base para fabricar el ADN (los nucleótidos de adenina, timina, citosina y guanina), y una pequeña cadena de ADN que pueda unirse a la molécula que queremos copiar para que sirva como cebadora (el cebador, en inglés "primer"). La sensibilidad de la técnica de PCR es muy alta pero presenta algunos inconvenientes, como son que no es una técnica cuantitativa y una relativamente alta probabilidad de obtener falsos positivos por contaminación. Para solventar este último problema se ha de optimizar la secuencia de los cebadores, así como la temperatura precisa para que estos se unan al ADN en la localización correcta y realizar una adecuada manipulación de los reactivos. Por otra parte para solventar el problema de la cuantificación se han generado unas variaciones sobre el esquema inicial de la PCR, dando lugar a lo que se conoce como PCR cuantitativa o PCR en tiempo real80, 81, 82, 83.

Debido a la elevada sensibilidad de la técnica, uno de los puntos más importantes a la hora de realizar una PCR en Tiempo Real, es la calidad del material de partida. Por ello, la extracción de los ácidos nucleicos de la muestra toma un papel crítico y fundamental. Aunque en los últimos años se han hecho grandes progresos en la simplificación de la extracción y

purificación de los ácidos nucleicos bacterianos y virales de muestras clínicas, todavía no se ha encontrado un método automático universal que se pueda utilizar con cualquier tipo de muestra. En esta parte vamos a revisar algunos de los principios básicos que pueden ayudar a desarrollar tanto protocolos nuevos de extracción como a mejorar los ya existentes eliminando el uso de soluciones peligrosas, centrifugaciones y múltiples pasos81, 82, 86, 87.

La Reacción en Cadena de la Polimerasa, es un procedimiento in vitro para la síntesis y duplicación de secuencias específicas de ADN. Esta tecnología utiliza secuencias de uno o dos oligonucleótidos sintéticos (iniciadores), generalmente de entre 10 a 30 pares de bases de longitud y complementarios a la secuencia nucleotídica de los extremos del ADN blanco y diseñados para hibridar en dirección contraria. El método implica la ejecución de una serie repetitiva de ciclos (conocidos como ciclos térmicos), cada uno de los cuales involucra: desnaturalización, hibridación y extensión. Lo anterior resulta en una acumulación exponencial de un fragmento específico de ADN. La ADN polimerasa es una enzima que cataliza la síntesis de ADN a partir de desoxirribonucleotidos y de una molécula de ADN plantilla o molde. Tras la acción de la ADN polimerasa, y una vez que se han eliminado y añadido alrededor de unas 10 bases, interviene la enzima ADN ligasa que une los extremos libres del fragmento recién formados con el resto de la cadena, recuperando así el ADN su estructura normal. Los protocolos básicos de PCR constan de los siguientes pasos fundamentales: desnaturalización, hibridación y polimerización83, 84, 85.

El PCR tiene varios requerimientos, entre los cuales es indispensable un molde de ADN, moléculas iniciadoras llamadas “primers”, una enzima ADN polimerasa resistente a las fluctuaciones de temperatura, una mezcla de desoxirrinucleótidos trifosfatos (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), un amortiguador apropiado y un equipo llamado “termociclador” que tiene la capacidad de cambiar las temperaturas dependiendo del ciclaje programado. La PCR consiste en tres pasos esenciales: el primero es la desnaturalización y sirve para separar mediante temperatura (94°C) la molécula doble de ADN a cadenas sencillas, que servirán como moldes para la síntesis del (o los) fragmento respectivo. En el segundo paso la temperatura se reduce para permitir el alineamiento (o reconocimiento) de las moléculas iniciadoras a La secuencia blanco del ADN molde. Las moléculas iniciadoras pueden variar en longitud, composición de bases nitrogenadas y especificidad para parearse con la secuencia blanco y dependiendo de esto, la temperatura de alineamiento puede variar desde 25°C a 65°C. En el tercero se lleva a cabo el alargamiento o extensión de la molécula iniciadora mediante la enzima ADN polimerasa a 72°C. Lo más recomendable es que el ADN polimerasa seleccionada tolere la

temperatura de desnaturalización y se mantenga activa durante el número de ciclos que se requieran; por ejemplo en muchas investigaciones se utiliza la ADN polimersa Taq, proveniente de la bacteria termófila Termus aquaticus, debido a que tolera la temperatura de desnaturalización sin alterar su función de polimerización. Estos 3 pasos (ciclos) se repiten en el termociclador, permitiendo obtener de manera exponencial el fragmento o fragmentos discretos sintetizados a partir del molde de ADN; por ejemplo, en una reacción de 30 a 35 ciclos, se acumularán alrededor de 106 a 108 moléculas de ADN72.

2.2.17. Electroforesis.

La concentración e integridad del ADN extraído, así como el tamaño de distintos fragmentos de ADN (por ejemplo, productos de PCR) pueden ser verificadas mediante electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida. La electroforesis consiste en la separación de moléculas (proteínas, isoenzimas, ácidos nucleicos) a través de una matriz tamponada (agarosa, acrilamida, almidón). La matriz funciona como un filtro, separando las moléculas en un campo eléctrico, de acuerdo al tamaño y la carga neta que poseen. En el caso de los ácidos nucleicos, el grupo fosfato es el responsable por la fuerte carga negativa en condiciones de pH neutro, haciendo que los fragmentos migren hacia el polo positivo (ánodo) durante la electroforesis72, 86.

La resolución y velocidad de separación de fragmentos de ADN por electroforesis son reguladas a través de la concentración de agarosa (o acrilamida) en el gel y el voltaje aplicado durante la electroforesis. Los ácidos nucleídos separados en geles de agarosa pueden visualizarse mediante tinción con colorantes fluorescentes, lo cual permite evaluar su integridad y estimar su concentración mediante un análisis comparativo con patrones de concentración conocida. Los colorantes fluorescentes actúan mediante inserción entre las pares de bases que conforman el ácido nucleíco. El bromuro de etidio es ampliamente utilizado para la visualización de ADN y ARN. Sin embargo, éste es un reactivo altamente tóxico, con propiedades mutagénicas, por lo que debe ser manejado con extremo cuidado en el laboratorio. En la actualidad existen colorantes fluorescentes alternativos, como SYBR Safe, SYBR Gold, SYBR Green I, Vistra Green y Syto60, desarrollados específicamente para reducir los riesgos potenciales de mutagénesis72,85, 86.

Electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida es el método estándar utilizado para separar, identificar y purificar los fragmentos de ADN. El proceso de separación por electroforesis depende básicamente del tamaño del fragmento, de la concentración de la agarosa y del voltaje aplicado durante la electroforesis. La agarosa se comporta como filtro, separando los fragmentos de diferentes tamaños; se observa que los

fragmentos menores migran más rápidamente en dirección al polo positivo, mientras que los fragmentos de mayor longitud migran lentamente. De esta manera, los fragmentos de diferentes tamaños son separados a lo largo del gel de agarosa. Al incrementar la concentración de agarosa se dificulta el movimiento de los fragmentos a lo largo de la superficie, permitiendo obtener una mayor resolución en la separación de fragmentos de menor longitud. Mientras que la reducción de la concentración favorece la separación de fragmentos mayores. El incremento del voltaje aumenta proporcionalmente la velocidad de migración de los fragmentos a lo largo de la matriz27, 86, 87.